堿性調(diào)寧蛋白的研究進展

王書美，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021）

脊椎動物調(diào)寧蛋白（calponin）是一個家族，按其等電點（isoelectric point，pI）分為堿性調(diào)寧蛋白（h1 calponin，h1CaP，pI 8～10），中性調(diào)寧蛋白（h2 calponin，h2CaP，pI7～8），酸性調(diào)寧蛋白（h3 calponin，h3CaP，pI5～6）。h2CaP與h1CaP有很高的同源性，主要分布于心肌組織中，人角化細胞中也有其存在。h3CaP廣泛表達，但在腦組織中含量最豐富。這3個成員的前273個氨基酸殘基具有很高的同源性（＞70％），都是由單一CH結(jié)構(gòu)域（calponin homologydomain）和29個氨基酸殘基組成的CLR（calponin-like repeat）三拷貝串聯(lián)重復(fù)序列組成。但它們的羧基末端序列有較大的差異。

h1CaP是肌動蛋白結(jié)合蛋白家族成員［1］，主要表達于終末分化和非增殖性的平滑肌細胞中，含量與原肌球蛋白（tropomyosin）相似，為肌動蛋白的1/7。Takahashi等［2］首先從雞砂囊平滑肌組織中提純出h1CaP，隨后，證實血管、胃、子宮、輸尿管、膀胱和輸精管等組織的平滑肌細胞中均有h1CaP表達。h1CaP主要在平滑肌細胞中表達，具有很強的組織特異性，參與平滑肌收縮的調(diào)控。

1 堿性調(diào)寧蛋白的分子生物學(xué)特點

編碼人h1CaP的CNN1基因位于19p13.2，小鼠的cnn1基因位于9q，大鼠的cnn1基因位于8q。編碼人h1CaP的cnn1基因跨度超過11kb，包含7個外顯子，人h1CaP為一297個氨基酸的蛋白［3，4］。

h1CaP分子結(jié)構(gòu)主要由氨基末端的單一CH結(jié)構(gòu)域和羧基末端的CLR多拷貝的串聯(lián)重復(fù)序列組成［5］。單一CH結(jié)構(gòu)域與MAPK（mitogen—activated protein kinase）信號途徑中的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated kinase，ERK）直接相互作用［6］，可能有利于信號分子定位于肌動蛋白細胞骨架。CLR結(jié)構(gòu)域是由29個氨基酸組成的一個獨立單元，以單個或多個拷貝串聯(lián)重復(fù)而形成的一種結(jié)構(gòu)方式，該結(jié)構(gòu)是calponin蛋白家族的一個重要特征。目前認為，CLR具有穩(wěn)固肌動蛋白細胞骨架的作用。h1CaP的羧基端有3個CLR，構(gòu)成一個獨立的肌動蛋白結(jié)合位點（actin binding site，ABS），稱為ABS2。CLR非競爭性與肌動蛋白結(jié)合是其穩(wěn)定肌動蛋白纖維的重要因素之一。此外，在h1CaP，CLR結(jié)構(gòu)域的氨基端142-163個氨基酸區(qū)域也具有肌動蛋白結(jié)合功能，稱為ABS1（actin binding site 1），但缺失ABS1的h1CaP仍然具有肌動蛋白結(jié)合活性［7］。

2 堿性調(diào)寧蛋白的生物學(xué)作用

20世紀90年代，h1CaP作為平滑肌分化的標記，研究者的研究主要集中在其結(jié)合肌動蛋白，抑制肌球蛋白ATP酶（myosin ATPase，簡稱ATP酶）方面。近年來，發(fā)現(xiàn)h1CaP可調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架的穩(wěn)定性，認為h1CaP可作為重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合分子，這種作用主要表現(xiàn)在控制基于肌動蛋白的細胞進程上。現(xiàn)在研究也表明h1CaP不僅作為平滑肌分化的可靠標記，還可預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后情況。

2.1 h1CaP參與平滑肌收縮的調(diào)控

平滑肌收縮的細胞內(nèi)信息傳遞包括肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）兩條途徑.MLCK使肌球蛋白輕鏈上絲氨酸-19磷酸化，PKC使h1CaP和Caldes mon（另一種平滑肌調(diào)控蛋白）磷酸化，導(dǎo)致ATP酶活性增加，平滑肌收縮［8］。

h1CaP結(jié)合肌動蛋白的細肌絲，原肌球蛋白，鈣調(diào)蛋白，抑制肌動蛋白活化的肌球蛋白Mg-ATPase活性和在固定化的肌球蛋白抑制Ca2+-依賴的肌動蛋白的移動性［1，9-12］，誘導(dǎo)F-肌動蛋白絲的構(gòu)象改變和通過肌球蛋白減少橫橋周期，增加最大力度的產(chǎn)生［13，14］。

2.2 參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

調(diào)寧蛋白除了結(jié)合肌動蛋白外，還與很多蛋白配體結(jié)合，其中許多參與信號通路。h1CaP具有多個信號分子蛋白的結(jié)合域，如ERK，PKC等都可與它結(jié)合。這些信號傳導(dǎo)通路與各種調(diào)節(jié)平滑肌細胞增殖的物質(zhì)之間均存在著廣泛的聯(lián)系，h1CaP可能就在其中發(fā)揮著重要的作用。

h1CaP還可以被多種激酶磷酸化，有報告指出h1CaP是MAPK［15］，rho激酶［16］，PKC［17］多種激酶的底物，表明h1CaP除了調(diào)節(jié)平滑肌收縮，還可能通過細胞間的粘接、胞質(zhì)分裂、細胞分化和增殖參與調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2.3維持細胞骨架

h1CaP作為肌動蛋白細胞骨架結(jié)合蛋白，可通過與F-肌動蛋白相互作用來調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架重構(gòu)。h1CaP主要有兩個結(jié)構(gòu)域：一是肌動蛋白結(jié)構(gòu)域，能與肌動蛋白的羧基端結(jié)合，從而阻抑肌動蛋白對ATP酶的激活作用。二是鈣調(diào)蛋白結(jié)合域，有人推測，h1CaP與鈣調(diào)蛋白結(jié)合后.會逆轉(zhuǎn)前者對ATP酶的抑制。

在體外，h1CaP結(jié)合磷脂，特別是帶負電荷的如磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇［18］，連接不同類型細胞的質(zhì)膜。當(dāng)細胞受激動劑刺激時，h1CaP從細胞骨架向質(zhì)膜易位［15］。

2.4參與血管病變及腫瘤的基因調(diào)節(jié)

h1CaP作為平滑肌細胞分化的標志物，除了調(diào)節(jié)平滑肌收縮之外，還能抑制細胞增生。過表達的h1CaP能抑制多種細胞的增生，而其表達降低或缺失則見于許多細胞增生性疾病。在許多種人類軟組織和骨瘤中發(fā)現(xiàn)h1CaP蛋白和mRNA的表達，包括卡波西肉瘤，骨肉瘤，平滑肌肉瘤，骨的成纖維細胞瘤，滑膜肉瘤，惡性纖維細胞瘤，脂肪肉瘤，惡性神經(jīng)鞘瘤，胃腸道基質(zhì)瘤，副脊索瘤，以及唾液腺的肌上皮癌等，h1CaP在這些軟組織和骨瘤中表達均比正常組織下調(diào)。

Negoro等［19］發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化的早期（內(nèi)膜無增生或輕度增生），大部分中層平滑肌細胞表達h1CaP，而處于增殖及向內(nèi)膜遷移狀態(tài)的平滑肌細胞不表達h1CaP。Takahashi等［20］利用兔頸動脈球囊損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，血管損傷早期管壁中層平滑肌細胞h1CaP表達下調(diào)，同時伴有平滑肌細胞數(shù)量增加。Taniguchi等［21］在正常的小鼠和h1CaP缺陷小鼠中注射B16黑色素瘤細胞，在h1CaP缺陷小鼠的肺中發(fā)現(xiàn)更多的遷徙小瘤。這是因為h1CaP缺陷小鼠的血管沒有完全發(fā)育成熟，非成熟的血管結(jié)構(gòu)上脆弱，增加了癌細胞的血源性轉(zhuǎn)移。h1CaP的缺失妨礙腫瘤新血管的形成及成熟，說明h1CaP參與血管病變的基因調(diào)節(jié)。

最近的研究表明攻擊性的腫瘤擴散與周圍間質(zhì)細胞中h1CaP及α-平滑肌肌動蛋白的減少有關(guān)。在基因敲除實驗中，h1CaP缺陷小鼠在一些組織中表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)脆性，例如血管，子宮，腹膜，導(dǎo)致癌癥細胞造血轉(zhuǎn)移和腹膜散布［21］。經(jīng)h1CaP治療后，腹膜疾病被抑制，這表明h1CaP通過穩(wěn)定腹膜防御腫瘤散布。

近年來，在平滑肌肉瘤，人類惡性黑素瘤，肝細胞癌，腎細胞癌，結(jié)腸癌等的血管中發(fā)現(xiàn)h1CaP表達下降。用h1CaP轉(zhuǎn)染平滑肌細胞，成纖維細胞、纖維肉瘤HT1080細胞或平滑肌肉瘤細胞可抑制細胞增殖和致瘤性。在平滑肌肉瘤中（一種子宮平滑肌新生物），h1CaP表達減少，將h1CaP轉(zhuǎn)染人類平滑肌肉瘤細胞系，發(fā)現(xiàn)h1CaP可抑制腫瘤細胞增殖［22］。黑素瘤細胞系的體外實驗表明h1CaP表達水平升高可減少細胞的運動［23］。臨床上肝細胞癌患者血管中h1CaP表達下降，促腫瘤血管成熟的h1CaP表達較高的肝細胞癌患者無瘤生存率明顯更高，且肝細胞癌患者h1CaP的表達水平與疾病的預(yù)后相關(guān)，h1CaP蛋白表達的免疫組化分析可作為預(yù)測肝細胞癌患者肝切除后預(yù)后情況的新方法［24］。Islam等［25］在腎細胞癌的侵潤性瘤，肉瘤等發(fā)現(xiàn)h1CaP表達較低，h1CaP維持血管完整性的功能不能較好的發(fā)揮，腎腫瘤血管中h1CaP的表達可作為腎細胞瘤的一種新的重要的病理學(xué)因子。Kaneko等［26］在v-src轉(zhuǎn)化的大鼠成纖維細胞系SR-3Y1中發(fā)現(xiàn)，h1CaP主要通過減少血管內(nèi)皮細胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達和血管發(fā)生，發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用。Yanagisawa等［27］也發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織周圍區(qū)域的血管h1CaP的表達隨著腫瘤進展，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血管浸潤和復(fù)發(fā)顯著降低。癌組織周圍區(qū)域h1CaP的表達與VEGF呈負相關(guān)。Takeoka等［28］發(fā)現(xiàn)h1CaP基因通過穩(wěn)定肌動蛋白絲，增強integrinα5β1系統(tǒng)的粘連抑制人類纖維肉瘤細胞的生長。此外，Suzuki等［29］的預(yù)試驗，發(fā)現(xiàn)急性主動脈壁夾層形成病人的h1CaP水平比對照組高，可作為急性主動脈壁夾層形成的早期診斷標志。

大量增加的證據(jù)表明，h1CaP為調(diào)節(jié)癌細胞增殖和遷移的關(guān)鍵分子之一。在癌組織的血管中h1CaP的表達水平結(jié)合常規(guī)的腫瘤分類操作可作為癌癥轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后有用的診斷標記。作為腫瘤抑制因子，h1CaP有用于基因治療的巨大潛力，用h1CaP基因治療癌癥可能有效地抑制腫瘤的惡性擴散和保護宿主正常組織免受癌細胞浸潤。

3 小結(jié)

堿性調(diào)寧蛋白是一種分化標志蛋白，在分化型平滑肌細胞中大量表達。它通過與肌動蛋白相結(jié)合，參與肌動蛋白細胞骨架重構(gòu)，具有多種生物學(xué)功能。其表達改變與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，研究其生化特征及生化分子機理，能為預(yù)防和治療平滑肌相關(guān)疾病及腫瘤，提供理論與實驗基礎(chǔ)。調(diào)寧蛋白行使腫瘤抑制因子的功能，將h1CaP互補DNA轉(zhuǎn)移進未分化的腫瘤細胞具有潛在的治療價值。

［1］WinderSJ，WalshMP.Calponin：Thin filament-linked regulation of smooth muscle contraction［J］.Cell Signal，1993，5：677-686.

［2］Takahashi K，Hiwada K，Kokubu T.Vascular smooth muscle calponin：a novel troponin T-like protein［J］.Hypertension，1988，11：620-626.

［3］Miano JM，Krahe R，Garcia E，et al.Expression，genomic structure and high resolution mapping to 19p13.2 of the human s mooth muscle cell calponin gene［J］.Gene，1997，197：215-224.

［4］Takahashi K，Nad-Ginard B.Molecular cloning and sequence analysis of smooth muscle calponin［J］.J Biol Chem，199l，266：13284-13288.

［5］Goodman A，GoodeBL，Matsudaira P，et al.The saccharomyces cerevisiae calponin/transgelin homolog Scp1 functions with fimbrin to regulate stability and organization of the actin cytoskeleton［J］.MolBiol Cell，2003，14：26l7-2629.

［6］Morgan KG，Gangpadhyay SS.Signal transduction in s mooth muscle：Invited review：Cross-bridge regulation by thin filamentassociated proteins［J］.J Appl Physiol，200l，91：953-962.

［7］Gimona M，Kaverina I，Resch GP，et a1.Calponin repeats regulate actin filament stability and for mation of podosomes in s mooth muscle cells［J］.MolBio cell，2003，14：2482-2491

［8］Stull JT，Herring BP，Gallagher PJ.Vascular smooth muscle contractile elements.Cellular regulation［J］.Hypertention，l991，17：723-732.

［9］TakahashiK，Hiwada K，Kokubu T.Isolation and characterization of a 34，000-dalton calmodulin-and Factinbinding protein from chicken gizzard smooth muscle［J］.Biochem Biophys Res Commun，1986，141：20-26.

［10］Childs TJ，Watson MH，Novy RE，et al.Calponin and tropomyosin interactions［J］.Biochem Biophys Acta，1992，1121：41-46.

［11］Graceffa P.Evidence for interaction between smooth muscle tropomyosin and caldesmon［J］.FEBS Lett，1987，218：139-142.

［12］ShirinskyVP，Biryukov KG，Hettasch JM，et al.Inhibition of the relative movementof actin andmyosin by caldes mon and calponin［J］.J Biol Chem，1992，267：15886-15892.

［13］Noda S，Ito M，Watanabe S，et al.Conformational changes of actin induced by calponin［J］.Biochem Biophys Res Commun，1992，185：481-487.

［14］Haeberle JR.Calponin decreases the rate of cross-bridge cycling and increases maximum force production by s mooth muscle myosin in an in vitro motility assay［J］.J Biol Chem，1994，269：12424-12431.

［15］Menice CB，Hulvershorn J，Adam LP，et al.Calponin and mitogen-activated protein kinase signaling in differentiated vascular smooth muscle［J］.J Biol Chem，1997，272：25157-25161.

［16］Kaneko T，AmanoM，Maeda A，et al.Identification of calponin as a novel substrate of rho-kinase［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，273：110-116.

［17］Leinweber B，Parissenti AM，Gallant C，et al.Regulation of protein kinase C by the cytoskeletal protein calponin［J］.J Biol Chem，2000，275：40329-40336.

［18］Fujii T，Yamana K，Ogoma Y，et al.Interaction of calponinwith phospholipids［J］.J Biochem，1995，117：999-1003.

［19］Negoro N，F(xiàn)ukui R，Tsuchikane E，et al.Down expression of Calponin in smooth muscle of coronary artery lesion identifies a group of lesion at high risk for restenosis after athetectomy［J］.Circulation，1994，90：142.

［20］TakahashiK，F(xiàn)ukuiR，Kato O，eta1.Percutaneous transulnminal transferof the human Calponin gene for suppression of intimal hyperplasia following arterial balloon injury：A model for Successful gene therapy for restenosis［J］.Circulation，1993，88：657.

［21］Taniguchi S，Takeoka M，Ehara T，et al.Structural fragility of blood vessels and peritoneum in calponin h1-deficient mice，resulting in an increase in hematogenousmetastasis and peritoneal dissemination of malignant tumor cells［J］.Cancer Res，2001，61：7627-7634.

［22］Horiuchi A，Nikaido T，Taniguchi S，et al.Possible role of calponin h1 as a tumor suppressor in human uterine leiomyosarcoma［J］.J Natl Cancer Inst，1999，91：790-796.

［23］Koganehira Y，TakeokaM，Ehara T，et al.Reduced expression of actinbinding proteins，h-caldes mon and calponin h1，in the vascular s mooth muscle inside melanoma lesions：an adverse prognostic factor for malignant melanoma［J］.Br J Dermatol，2003，148：971-980.

［24］Sasaki Y，Yamamura H，Kawakami Y，et al.Expression of s mooth muscle calponin in tumor vessels of human hepatocellular carcinoma and its possible association with prognosis［J］.Cancer，2002，94：1777-1786.

［25］Islam AH，Ehara T，Kato H，et al.Calponin h1 expression in renal tumor vessels：correlationswithmultiple pathological factors of renal cell carcinoma［J］.J Urol，2004，171：1319-1323.

［26］KanekoM，TakeokaM，OguchiM，et al.Calponir h1 supresses tumor growth of src-inluced transformed 3Y1 cells in association with a decrease in angiogenesis［J］.Jpn J CancerRes，2002，93：935-943.

［27］Yanagisawa Y，Takeoka M，Ehara T，et al.Reduction of Calponin h1 expression in human colon cancer blood vessels［J］.EJSO，2008，34：531-537.

［28］TakeokaM，Ehara T，Sagara J，et al.Calponin h1 induced a flattened morphology and suppressed the growth of human fibrosarcoma HT1080 cells［J］.Eur J Cancer，2002，38：436-442.

［29］Suzuki T，Distante A，Zizza A，et al.Preliminary experience with the smooth muscle troponin-like protein，calponin，as a novel biomarker for diagnosing acute aortic dissection［J］.Eur Heart J，2008，29：1439-1445.