實驗動物皮膚病原真菌DNA快速少量提取法

劉福英

(河北醫科大學 河北省實驗動物重點實驗室，石家莊 050017)

實驗動物皮膚病原真菌DNA快速少量提取法

劉福英

(河北醫科大學 河北省實驗動物重點實驗室，石家莊 050017)

PCR技術應用于實驗動物皮膚病原真菌檢測，方法簡單、省時。但是，真菌的DNA提取較為困難。本文推薦一種既簡單又經濟快速的提取皮膚真菌DNA的方法，并能成功用于實驗動物皮膚病原真菌質量檢測研究。

實驗動物;皮膚病原真菌;DNA提取

引起實驗動物皮膚真菌病的病原菌，主要是羊毛狀小孢子菌(Microsporum lanosum)、石膏樣小孢子菌(Microsprum gypseum)和石膏樣毛癬菌(Trichonohytom mentagrophytes)，以上三種真菌是哺乳類實驗動物必須排除的皮膚病原菌。不論是從動物皮膚病灶處或非病灶處分離到這三種菌，均視為異常。因為，非病灶處的真菌很可能隨后引起實驗動物真菌感染，同時對飼養和實驗人員構成威脅。

常規的對實驗動物皮膚真菌檢測程序主要包括，刮取動物皮毛鱗屑、沙氏培養基斜面培養、菌落觀察、涂片鏡檢和報告結果。對可疑病灶，亦可刮取皮毛、鱗屑直接顯微鏡下觀察。進而根據菌落形態和鏡檢特征及其生化特點，確定皮膚病原真菌菌種。這種方法要求檢驗人員具有多年的實踐經驗，熟悉掌握真菌菌種鑒別方法。由于真菌的表型特征很容易受到外界因素的影響，例如溫度變化，培養基和化學治療，這些都影響真菌代謝過程，尤其是皮膚癬菌的菌落易發生變異，加上檢測人員的人為因素影響，都會影響檢測結果。并且要得到典型的形態學和鏡下特征一般需要2～3周的培養時間。對一些缺少特異的形態及鏡下特征的菌種還需要進行特殊培養基的第二次培養，這樣又將延遲幾個星期的時間。因此，實驗動物皮膚真菌的傳統檢測方法既費力又費時，不能滿足準確、快速的目的。

以聚合酶鏈反應為基礎的分子生物學技術克服了表型分型的不足，在真菌的分類和診斷方面顯示出較大的優勢和潛力。核酸檢測方法，如PCR技術，已用于微生物鑒定和診斷研究［1，2］。雖然各種絲狀真菌均能用于PCR擴增，同時真菌DNA的提取方法不斷地改進。然而，因為真菌DNA提取的質量關系到最終的鑒定結果，因此DNA的提取方法得當與否，起很重要作用。到目前為止，已有多種真菌DNA提取方法，如使用破壁酶、玻璃珠法、使用研缽研磨的方法等，目的均是破壞真菌的細胞壁。如果這些方法用于大樣本量的檢測則顯示出不足和缺陷，因為DNA的抽提過程步驟繁瑣、耗時，并且其過程中還要設法避免真菌的污染，這常使工作人員疲勞和厭倦。

實驗動物皮膚真菌的檢測工作通常樣本量較大，需要建立一種用于PCR方法真菌檢測，快速、低耗并且獲得可靠DNA的提取方法，以減少技術人員的工作量而且縮短檢測時間。我們對照比較了幾種DNA的提取方法［3－7］的優缺點，最后選擇了一種快速、小量的真菌DNA提取方法。

該方法包括以下步驟:(1)用接種針從沙氏斜面固體培養基刮取少量病原真菌菌絲，放入1.5mL Ep管內，在未加入緩沖液前，用無菌牙簽的尖端貼管壁輕輕攪拌，以破壞菌絲外層細胞壁。之后，加入 500 μL 緩沖液(400mmol/L Tris-HCl pH8.0，60mmol/L EDTA pH8.0，150mmol/L NaCl，1%SDS)，用漩渦震蕩器充分混勻后，室溫靜置10 min。(2)加入150 μL 5 mol/L醋酸鉀 pH 4.8(醋酸鉀 60mL，冰醋酸11.5mL，蒸餾水 28.5mL)，簡單混勻，離心15000 r/min，1 min，上清液移至1.5mL Ep管內，細胞碎屑及蛋白沉淀棄去，重復步驟(2)一次;然后上清液移至另一個1.5mL Ep管內。(3)加入等體積異丙醇，顛倒混勻，離心15000 r/min，5min，棄上清。(4)沉淀加入 500 μL 70%酒精，離心12000 r/min，1 min，棄上清，沉淀在室溫下晾干，約10 min，使酒精揮發，加50 μL 無菌水溶解。取1 μL用于PCR擴增。

該方法用于實驗動物皮膚真菌DNA的提取，整個步驟能在1 h內完成。目前我們在對普通級和清潔級實驗動物皮膚病原真菌檢測中，使用此方法對真菌的DNA進行了提取，在瓊脂糖電泳中可看到清晰的DNA條帶，使用真菌通用引物做PCR能擴增出清晰的目的產物［8，9］。以上結果表明這種快速、可靠、低成本的提取DNA的方法，可以用在實驗動物的皮膚病原真菌的實驗室研究和實驗動物質量檢測。

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［2］Hirai A，Kano R，Nakamuura Y，et al.Molecular taxomomy of dermatophytes and related fungi by chitin synthase 1(CHS 1)gene sequences［J］.Antoie Van Leeuwenhoek，2003，83(1):11－20.

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［9］龔巧玲，鄭龍，張煥鈴.PCR方法檢測實驗動物皮膚病原真菌［J］. 中國比較醫學雜志，2007，17(3):131－135.

A Rapid DNA Isolation Method from Pathogenic Dermatophytes in Laboratory Animals

LIU Fu-ying
(Hebei Key Lab of Laboratory Animal Science，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China)

The PCR technology is used in laboratory animal pathogenic dermatophytes detection，it is a simple and time saving method.However，the fungal DNA extraction is difficult.This paper recommends a simple，rapid and economic method for skin fungal DNA extraction;also this method can be used in the quality detection of pathogenic dermatophytes in laboratory animals.

Laboratory animal;Pathogenic dermatophytes;DNA extraction

R332

A

1671-7856(2010)09-0001-02

2010-01-25

劉福英，男，教授，主要研究方向:實驗動物管理及人類疾病動物模型。E-mail:lfy5579@126.com。