胞內感染菌抗性侯選基因SLC11A1研究進展＊

徐 佳,丁世才,王生奎,柴 俊,劉旭川,孫紹美,史憲偉,張以芳

胞內感染菌抗性侯選基因SLC11A1研究進展＊

徐 佳1,丁世才2,王生奎1,柴 俊3,劉旭川3,孫紹美1,史憲偉1,張以芳1

20世紀初,研究者發現近交系小鼠中,一種遺傳因素可以影響宿主對包括鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium),杜氏利什曼原蟲 (Leishmania donovani),卡介苗分支桿菌(BCG)等胞內病原體的早期反應。抵抗這些病原體相關的基因分別稱為Ity、Lsh、Bcg基因。此后人們發現不同鼠系對結核分支桿菌感染耐受性不同。Bcg基因也對鼠傷寒沙門菌和杜氏利什曼原蟲敏感性基因連鎖,統稱為Ity/L sh/Bcg基因;當以上基因分別獨立定位于小鼠1號常染色體定位的同一個位置時,研究者認為是同一個基因參與了宿主抵抗機制,并命名為Bcg基因。1993年,Vidal等通過定位克隆的方法分離出Bcg的候選基因溶質性載體蛋白家族11成員1(Solute carrier family 11 member 1,SLC11A 1)〔1〕。SLC11A 1曾被命名為自然抗性相關巨噬細胞蛋白(natural resistance associated macrophagee protein,NRAM P1)。

SLC11A 1與宿主對一些病毒、細菌、寄生蟲等引起的傳染病(如:結核病、麻風病)的抗性相關,同時也與一些自身免疫性疾病(如:川崎病、幼年型類風濕性關節炎、風濕性關節炎、腸炎病〔2〕、糖尿病)和癌癥的發生存在密切聯系。細菌、病毒、寄生蟲的感染,長期接觸刺激性化學藥品或者非消化性的顆粒往往導致機體慢性炎癥,而慢性炎癥使機體自身免疫病和癌癥發病率增高。

結核病是一重大的公共衛生問題,根據世界衛生組織公布,全球結核病每年的新增病例約8百萬,每年約有2百萬人死于結核病。但結核病感染人群中只有10%發病。以往國內結核病研究主要集中于致病菌本身以及環境因素(糖尿病、酗酒、H IV感染病人和長期應用糖皮質激素)的影響。隨著基因組流行病學發展,宿主抗性基因成為新的研究熱點,SLC11A 1便是一個主要的自然抗性候選基因。

1 SLC11A1基因

人的 SLC11A 1基因位于2號染色體長臂(2q35)全長14kb。包含15個外顯子。由A lu元件和4個內含子分開。與鼠同源性為89%,只有一個拷貝。在5’和3’非編碼區(untranslated region,U TRs)、內含子存在明顯的種屬差異性。

人類SLC11A 1m RNA長2.5kb。SLC11A 1基因3’非編碼區包含四個AUUUA重復序列,是一種富含AU的重復序列(AU-rich element,ARE),該重復序列位于2248到2287長約40bp。這些序列與短壽命的致癌基因、細胞因子和生長因子等的m RNA中發現的一些不穩定序列具有同源性。ARE可以通過結合RNA結合蛋白,調控這些m RNA的生成和降解的。小鼠SLC11A 1 3’U TR不含有ARE,其SLC11A 1m RNA具有較長半衰期。

SLC11A 1基因至少有4種多態性可能影響機體對胞內感染菌的抗性,包括啟動子的多態性;第4內含子的單個核酸469+14G/C改變(IN T4)多態性;第 543位密碼子的非保守堿基 G/A替換(D543N)多態性和3’U TR TGTG缺失多態性。

1.1 SLC11A 1啟動子多態性 SLC11A 1 5’末端的Z-DNA微衛星重復序列啟動子有四個等位基因。等位基因1和4的頻率為0.001,等位基因2的頻率為0.2-0.25,等位基因3的頻率為0.75-0.8。等位基因1、2、4為弱啟動子,等位基因3為強啟動子。等位基因2和等位基因3為人類兩個主要的SLC11A 1啟動子等位基因。這兩個等位基因對于SLC11A 1表達水平具有相反的作用。等位基因2,T(GT)5AC(GT)5A C(GT)10GGCA GA(G)6導致SLC11A 1基因低水平地表達,與胞內感染性疾病有關。相反等位基因3,T(GT)5AC(GT)5AC(GT)9GG CAGA(G)6促進SLC11A 1基因高水平地表達,與自身免疫疾病和癌癥。有關〔3〕。地域性傳染病多發人群,等位基因3通常具有高的分布。而不同人群中存在基因的多樣性單模標本結構和連鎖不平衡現象,這會改變該人群對疾病的易感性和疾病的感染過程,甚至影響疫苗保護效價,以及預防用藥和治療用藥的醫療效果〔4〕。

1.2 IN T4與D543N多態性 對多個多態性位點進行單獨基因多態性分析和復等位基因分析,發現IN T4與D543N只有在形成的雜合子時對宿主抗性產生影響,推測各種基因多態性之間對宿主抗性有可能存在協同作用。

1.3 3’U TR TGTG缺失多態性 3’U TR TGTG缺失多態性可能通過影響正常的基因轉錄過程,導致感染結核后容易發病。

2 SLC11A1蛋白表達

2.1 表達SLC11A 1的細胞系 SLC11A 1在外周血中表達量最高,其次為肺和脾。SLC11A 1在人類網狀內皮系統的單核巨噬細胞表達量較高,在髓系細胞〔5〕、神經元細胞〔6〕和包括有垂體前葉、腎上腺髓質和胰島在內的內分泌組織中呈現限制性的表達特征。人類SLC11A 1基因轉化后的紅細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞和單核巨噬細胞途徑中的前體細胞(KG1,U 937,THP)和前髓白血病細胞系 HL-60中不能表達。但這些細胞在粒細胞或者單核巨噬細胞分化途徑過程中被區別處理后可以誘導SLC11A 1強烈表達,其影響機制還不清楚。

2.2 SLC11A 1轉錄的調控 SLC11A 1的調控機制在種間存在差異。不同物種間 SLC11A 1 U TR轉錄因子結合位點的類型和位置存在差異。人類活性轉錄因子3(activating transcrip tion factor-3,o r AP-1-like element,A TF3)的結合位點與5’Z-DNA型的微衛星多態性鄰近,但在小鼠中沒有發現這樣的鄰近。A TF3對于 TLR4有負調節作用〔7〕。A TF3與JUN蛋白形成異形二聚體可以激活SLC11A 1轉錄。但A TF3自己形成的同型二聚體與DNA結合時抑制 SLC11A 1轉錄。A TF3是基礎亮氨酸拉鏈型轉錄因子A TF/CREB家族的成員。正常條件下A TF3在大多數細胞系里面表達量相對較低,但在生理環境改變情況下,可作為一個快速早期反應基因被強烈誘導表達。這個B-DNA型序列是在大鼠腫瘤抑制基因啟動子(p53)和人類轉移生長因子B(transfom ing grow th fact B)基因中發現的。雖然它與 SLC11A 1 5’啟動子 Z-DNA型微衛星多態性鄰近。但是還不清楚這些微衛星是否是SLC11A 1 A TF-3結合位點。Z-DNA的結構對于調節抑制性染色質結構具有重要作用。A TF3結合位點可能是一個在SLC11A 1啟動子上的轉錄活性位點,Z-DNA微衛星重復鄰近區域的變異會阻斷的不同等位基因間的連鎖,可能會影響染色質的形態恢復和轉錄因子的接近〔8〕。

小鼠巨噬細胞中SLC11A 1的表達可被細菌的脂多糖、IFN-γ、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和炎癥刺激上調。

在區分處理后的 HL-60細胞中,SLC11A 1的誘導與SLC11A 1m RNA產生量有關?？梢酝ㄟ^調控m RNA的轉錄過程來調節SLC11A 1的表達量。包含有AREs的m RNA在沒有激活的細胞中快速降解,但在特殊的生長狀態或者應激狀況下,可以改變m RNA的降解速度。

SLC11A 1 ARE通過結合RNA結合蛋白,調控m RNA的生成和降解的?，F已經證實很多蛋白可以結合在3’U TR上,尤其是ARE上。在這些蛋白中,多形核核蛋白(DAU F1 o r heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D,hnRNP D)可以加速m RNA的降解,而 HuR穩定 m RNA阻礙其降解。HuR是胚胎致死性異常性家族(embryonic lethal abno rmal vision family)的 m RNA s結合蛋白,36-kDa,包含三個RNA識別位點。這些識別位點對于ARE具有高的親和力。HuR通過在細胞核內與特異的m RNA結合,與m RNA一同轉移到細胞質內,并使m RNA不快速降解。HuR通過作用于ARE對SLC11A 1基因進行轉錄后調控。但它是否能調節SLC11A 1基因的表達還沒有被證實。實驗表明HuR在佛波醇豆蔻酸鹽(phorbol myristate acetate,PMA)處理的細胞中SLC11A 1結合量大于沒有處理過的細胞。PMA誘導的細胞質的 HuR聚合物與 HuR在SLC11A 1 ARE結合量升高和SLC11A 1 m RNA產生量的升高平行相關。這表明 HuR細胞質內的量對于SLC11A 1表達的調控具有重要作用。同時,用RNA干擾劑RNAi下調 HuR的表達造成了SLC11A 1表達量下調,而該下調可以通過在在RNAi處理過的細胞中加入 HuR蛋白而得以修復。HuR在 HL-60細胞中的過度表達可以明顯增加SLC11A 1 m RNA的穩定性〔9〕。

2.3 SLC11A 1蛋白 SLC11A 1蛋白是一個高度糖基化和磷酸化的膜整合蛋白,具有2個N端糖基化位點及5個蛋白酶C磷酸化位點。分子量約90-110kDa。具有12個跨膜區(transmembrane domains,TMDs),該跨膜區為包括人類和細菌在內的不同的物種所具有。同時還有1個進化遺留下來的轉運點。

在SLC11A 1的MD4上的氨基酸169發生錯譯突變一個天然的甘氨酸(wild-type;Slc11a1wt)轉變成天冬氨酸(mutant;Slc11a1mut)導致小鼠對胞內病原體易感性增加。但是Slc11a1mut小鼠表形難以與SLC11A 1-/-中斷突變體區分。然而,在MD4上插入大的帶負電的天冬氨酸殘基將在巨噬細胞活化過程中發揮的多效性作用。但具體分子機制還不清楚。

Slc11a1wt巨噬細胞和 Slc11a1mut巨噬細胞的吞噬體和溶酶體膜上有低水平的SLC11A 1蛋白。在內涵體膜和Slc11a1mut巨噬細胞控制激活的溶酶體也發現了低水平的 SLC11A 1蛋白。大多SLC11A 1mut存在于內質網,其中含有部分糖基化中間產物。盡管 N端糖基化位點被阻斷了,但SLC11A 1wt能正確的轉移到內涵體內,糖基化并不影響蛋白質的空間折疊和分類。G169D突變體導致SLC11A 1定點錯誤折疊,從而被保留在內質網中,表現出功能的喪失。SLC11A 1的變種通常與感染性疾病或者自身免疫性疾病有關〔10〕。

3 SLC11A1作用機理

3.1 SLC11A 1與自由基 SLC11A 1蛋白存在于巨噬細胞的酸性的的吞噬體和溶酶體內。在靜息態的巨噬細胞SLC11A 1主要是在吞噬溶酶體中。但當巨噬細胞轉為激活態,SLC11A 1將會轉移到吞噬體溶酶體膜上,并充當一個順著金屬陽離子濃度梯度轉運二價金屬離子轉運體。同時二價金屬離子比如Fe2+、M n2+的濃度水平又反饋調節 SLC11A 1。正常生理狀態下,SCL 11A 1在細胞質與酸性吞噬體、溶酶體之間轉運二價金屬陽離子。酸性晚期吞噬體和溶酶體內發生 Fenton或者 Haber-Wesis反應,產生毒性抗菌的自由基,從而對吞噬體內的微生物產生直接的抗微生物活性〔11〕。巨噬細胞受外界刺激活化產生毒性自由基主要是活性氧和含氮自由基?；钚匝醢ㄓ羞^氧化物、單線態氧、過氧化氫、羥自由基〔12〕。含氮自由基主要是在一氧化氮合成酶作用下產生一氧化氮。細菌自身也會合成自身的以Fe2+或其他金屬離子為輔助因子的活性氧清除系統,如SOD、CA T等來清除自由基。SLC11A 1順濃度梯度外排金屬離子,讓細菌自身合成的自由基清除系統失活,從而由自由基清除機體病原微生物。是一種機體防御機制。

但同時,自由基長期積累往往導致組織損傷,誘發一些包括腫瘤和癌癥在內的漸進性發展疾病。來源于活化態巨噬細胞的過氧化氫可以一些過度元素結合,通過SLC11A 1轉運進溶酶體、晚期吞噬體內的DNA或者RNA或者擴散到原子核,引起變性損傷,甚至導致腫瘤變異。同時SLC11A 1是順p H梯度的由高到低轉運金屬離子。

檢測類風濕病人的滑膜和動脈粥樣硬化病人的泡沫細胞鐵離子明顯增高。這很有可能是與SLC11A 1相關。因為由死亡細胞釋放的核酸和蛋白質微粒作為自身抗原,能被具 T細胞受體(TLR)3,7,8,9激活了的B淋巴細胞識別,進而B細胞成為具有抗體產生能力的漿細胞〔13〕,SLC11A 1可能也與系統性紅斑狼瘡的發病機制有關。感染牛結核的小鼠吞噬體中SLC11A 1的含量明顯高于沒有被感染的小鼠。

3.2 SLC11A 1與免疫應答反應 胞內病原菌如沙門氏菌減弱菌株可以廣泛用作工程菌傳遞和表達疫苗抗原。而SLC11A 1可以通過控制細菌的復制、重組抗原劑量、M HCⅡ表達和佐劑的活性來影響重組細菌疫苗反應?；蛘咄ㄟ^控制晚期吞噬體蛋白酶活性來影響抗原加工,SLC11A 1在巨噬細胞中調控鐵離子的動態平衡從而多效性地影響巨噬細胞系統,包括增強干擾素(IL-1β)、促進趨化因子 KC(chemokine KC)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的生成〔14〕和促進一氧化氮的釋放(NO)。通過造成M HCⅡ表達數量上的差異,影響抗原信息傳遞給 T細胞的過程。通過序列測定和定點克隆,發現含有SLC11A 1的野生型等位基因老鼠活體中傾向于Th1的免疫反應。Th1細胞有益于抵抗巨噬細胞胞內病原體的感染,但是有可能造成Ⅰ型糖尿病。誘發Th2免疫反應的小鼠則含有突變體等位基因。

SLC11A 1促進炎性復合物的聚集和巨噬細胞分泌前白介素1β(IL-1β)和白介素18(IL-18)。并可以在細胞質解旋酶維甲酸誘導蛋白 Ⅰ(retinoic acidinducible protein I,RIG-I)和黑素瘤化相關蛋白5(melanoma differentiation-associated protein 5,MDA 5)作用下調控抗病毒反應。SLC11A 1通過調節細胞內核苷酸寡聚化結構域(nucleotide–oligomerization Domains,NODs)功能影響細胞凋亡過程。NODs是炎性復合物的組成部分。NODs蛋白功能的失去或者獲得會導致機體對幾種免疫反應失調喪失調控能力。細胞內基因在含鐵量降低時,阻礙細胞生長。所以SLC11A 1轉錄的激活導致細胞凋亡,相反,轉錄抑制時細胞繼續生存。SLC11A 1通過調節晚期吞噬體內抗原加工提呈過程和影響相關蛋白酶激活來影響病毒載體傳遞系統的免疫反應。例如皰疹病毒的Cp G載體傳遞系統、腺病毒雙鏈RNA、逆轉錄病毒載體、單鏈 RNA、腺病毒相關病毒載體單鏈DNA和桿狀病毒載體〔15-17〕。

SLC11A 1導致細胞因子在感染部位的聚集,并影響感染后的結果。例如巨噬細胞活化可能表現為只單獨存在IL-6、IL-6和 TGF-β兩者都有或者只有TGF-β三種狀態,表現何種狀態決定著何種型的Th細胞被激活。在 IL-6的單獨誘導下,前列腺素生成量提高。前列腺素在氧自由基的生成過程中有重要作用〔18〕。IL-6與 TGF-β協同對于幼稚 T細胞分化成為能產生IL-17前炎癥 Th細胞。在試驗動物模型中IL-17與慢性炎癥和自身免疫病的發生有關〔19〕。TGF-β可單獨在神經末梢周圍誘生抗炎癥的雙叉蛋白3(forkhead box protein.FOXP3)表達調控 T細胞〔20〕。結核皮膚測試陽性病例與陰性病例的FOXP3基因表達存在明顯差異。

另一類調節性T細胞在長期高水平的IL-10影響下缺乏FOXP3的生成。這類抑制性 T細胞能抑制特異性抗原反應和下調病理免疫反應。SLC11A 1啟動子等位基因2多態性,影響 IL-10的生成并造成不同年齡、性別、種族的結核病人或者結核痊愈病人產生高水平的IL-10。激活的巨噬細胞和主要SLC11A 1等位基因在SLC11A 1功能中發揮不同的作用。但是SLC11A 1怎樣通過調節這些細胞因子的生成而影響感染后的結果的機制還不清楚〔21〕。

4 展 望

根據SLC11A 1具體的作用機制可通過生物技術研發合成人類新型的具有廣譜抗菌作用抗生素藥品和保健藥物。在抗病育種方面也可培育廣譜抗病性的金屬離子高效吸收轉運的動、植物新品種。開展基因組流行病學研究,有助于肺結核等傳染病高危人群的預測,從而為優選干預措施提供科學依據。

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1002-2694(2010)11-1071-04

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A

＊云南省高層次科技人才培引工程(2009 CI 125)和云南省自然科學基金(2009 CD 058)項目聯合資助

張以芳,Email,zyfkm@yahoo.com.cn

1.云南農業大學動物科學技術學院,昆明 650201;2.云南省曲靖市婦幼醫院檢驗科,曲靖 655000;3.云南農業大學,昆明 650201

2010-05-26;

2010-08-31