中國6省萊姆病螺旋體主要宿主動物鼠的初步調查

侯學霞,耿 震,郝 琴,張 洋,萬康林

中國6省萊姆病螺旋體主要宿主動物鼠的初步調查

侯學霞,耿 震,郝 琴,張 洋,萬康林

目的 了解中國吉林、山西、甘肅、青海、貴州、湖南6省林區萊姆病螺旋體宿主動物鼠的感染情況。方法在每個省各選取兩個采樣點進行捕鼠,采用病原分離培養和巢式PCR方法對野鼠的脾臟、腎臟和膀胱進行了病原學檢測。并通過基因測序方法確定基因型。結果從貴州黑線姬鼠中分離到了2株萊姆病螺旋體;從5省(貴州未檢測到)野鼠的脾臟和/或腎臟中檢查到了萊姆病螺旋體的特異片段,其中青海黃南(28.85%)和湖南石門(19.6%)兩地標本的PCR陽性率較高,各地區陽性率的差異有統計學意義。通過序列同源性分析確定吉林、青海、甘肅和山西的基因型均為Borrelia garinii。湖南的基因型為Borrelia valaisiana。結論本次調查表明各地宿主動物鼠的感染狀況不同,各地應根據具體情況進一步擴大調查以明確當地的主要宿主動物種類及攜帶病原體情況。

萊姆病螺旋體;宿主動物;病原學檢測

萊姆病(Lyme disease)是一種人獸共患病,其病原體為伯氏疏螺旋體。蜱為其主要的傳播媒介,鼠類和一些小型哺乳動物可作為宿主動物,在不同國家和地區其宿主動物也存在一定的差別〔1-2〕。美國已從多種動物和和鳥類分離到該病原體,并認為白腳鼠和白尾鹿是最重要的動物宿主。我國已從白腹鼠、褐家鼠、黑線姬鼠和華南兔等動物中分離得到萊姆病螺旋體〔3-4〕。為了解我國萊姆病螺旋體主要宿主動物鼠的感染狀況,我們于2006年對中國吉林、山西、甘肅、青海、貴州和湖南6省進行了鼠帶菌率的調查。

1 材料和方法

1.1 調查點選擇 每省選2個調查點,吉林長白、通化;山西垣曲、交城;甘肅迭部、民樂;青海互助、黃南;貴州道真、務川;湖南瀏陽、石門,共12個調查點。

1.2 野鼠調查

1.2.1 病原體分離培養 在野外采用籠捕法抓活鼠,經無菌操作取活鼠或死亡不超過16h鼠的脾臟和腎臟(接近髓質的皮質),取綠豆大小的組織,接種于BSKⅡ培養基,33℃培養,7d后檢查,每周檢查1～2次,連續3個月培養為陰性棄去。

1.2.2 PCR檢測 鼠標本DNA模板的制備

①取3～5mm見方(約50mg)的脾或腎組織在研磨器中加入500μL的 TRIzol,研磨,將懸液 15 000r/min,離心15min;

②棄上清,加入150μL無水乙醇,反復混勻后室溫靜置2min,15 000r/min,離心5min;

③棄上清,加入0.1μL/l檸檬酸鈉和70%乙醇(檸檬酸鈉∶乙醇 =1∶9)500μL,反復混勻,室溫靜置30min,15 000r/min,離心5min;

④棄上清,加入75%乙醇500μL,反復混勻,室溫靜置15min,15 000r/min,離心5min;

⑤棄上清,將DNA室溫干燥15min;

⑥加入 TE(p H=8.0)液50μL,混勻;

⑦置-20℃儲存備用。

1.2.3 宿主動物鼠標本中萊姆病螺旋體的檢測 采用巢式PCR方法檢測帶菌情況。引物根據參考文獻〔5〕,以伯氏疏螺旋體5S-23SrRNA間隔區兩側基因高度保守區合成內外引物兩對。

第一輪上游:5′-CGACCTTCTTCGCCTTAAAGC-3′

第一輪下游:5′-TAAGCTGACTAATACTAATTACCC -3′

第二輪上游:5′-TCCTAGGCATTCACCATA-3′

第二輪下游:5′-GAGTTCGCGGGAGA-3′

反應條件見表1。

表1 PCR檢測反應條件Table 1 PCR conditionsof reaction

1.3 測序及序列分析 將PCR產物送上海生物工程有限公司測序,并用MegAlign軟件進行聚類分析。

1.4 菌株和主要試劑 標準菌株B31、BSKⅡ培養基由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所提供;TRIzol購于上海生物工程有限公司;100bpDNALadder、TaqDNA 聚合酶、dNTP、瓊脂糖、購于華美生物公司。

2 結 果

2.1 標本收集 2006年在我國6省山林地區共收集到野鼠463只,具體見表2。

2.2 病原檢測結果

2.2.1 對6省共400余只野鼠脾臟、腎臟和膀胱進行了病原分離培養,僅從貴州黑線姬鼠標本中分離到2株螺旋體,經單克隆抗體鑒定均為萊姆病螺旋體。

2.2.2 Nested-PCR檢測結果(見表2) 其中青海黃南28.85%、湖南石門19.6%的帶菌率較高,而吉林長白6.90%、甘肅民樂6.67%的帶菌率較低,差異有統計學意義(χ2=20.60,P<0.05)。

表2 中國六省不同地區鼠標本PCR檢測結果Table 2 PCR results for rats in different regionsof the six provinces

2.2.3 測序結果 我們從每個省鼠的PCR陽性產物中隨機挑選一份送公司測序,序列用MegAlign軟件進行聚類分析。結果顯示,湖南的序列 HNm1.seq與Borrelia valaisiana基因型的標準菌株UK的序列較為接近;而吉林、青海、甘肅和山西的序列與Borrelia garinii基因型的標準菌株20047的序列較為接近。

圖1 中國六省鼠標本PCR陽性產物序列聚類圖Fig.1 The dendrogram of the sequence of th PCR positioe produets of mouse in six provinces of China

3 討 論

本次調查顯示:通過巢式PCR方法從五省不同地區檢測到萊姆病螺旋體的特異片段,青海黃南(28.85%)和湖南石門(19.6%)兩地山林地區鼠的帶菌率為最高,各地區宿主動物鼠之間帶菌率的差異有統計學意義(χ2=20.60,P<0.05),原因可能為這些地區的地理環境,氣候條件等影響鼠的種類,而萊姆病帶菌率主要受鼠種差異的影響,不同鼠種攜帶的萊姆病螺旋體能力不同〔6-8〕。并經比對顯示,湖南存在Borrelia valaisiana基因型,這在我國是首次報道。吉林、青海、甘肅和山西存在Borrelia garinii基因型,這進一步提示了野鼠為萊姆病螺旋體的重要儲存宿主〔9-10〕。同時也證明吉林、貴州、甘肅的萊姆病基因型同已報道的萊姆病主要基因型相符〔11-12〕。其中山西、青海首次被列為萊姆病宿主動物調查地區,并且第一次在山西省發現了Borrelia garinii基因型,在湖南省發現了Borrelia valaisiana基因型,具有重要的流行病學和臨床意義,這項調查為當地萊姆病疫源地的發現和研究提供了重要證據。進一步的研究將填補我國山西和湖南兩省萊姆病新基因型的流行病學特征及其引發各種臨床癥狀的進展和臨床轉歸關系方面認識的空白,為進行有效防治提供重要的科學依據。但由于本研究從六省中每省只選取了兩個調查點采樣,這樣不能代表全省的情況,建議在每個省內至少選取4～5個調查點,因此尚需開展進一步調查研究,每一個調查點應該盡可能的從數量上多采集一些標本,樣本量過少容易發生統計學偏倚。貴州的鼠標本未能檢測到陽性,原因可能是樣本量過少,提示在今后的調查中應該增加樣本量以減少偏倚。

與病原體分離培養相比,Nested-PCR技術具有操作簡便、迅速的特點,因此越來越得到廣泛應用。據文獻報道〔13〕,對現場捕獲的動物組織直接進行PCR擴增,其敏感性高于病原體分離培養,不會存在螺旋體分離培養過程菌株的選擇作用,使結果更加接近于螺旋體在自然界中的原貌,而且通過核苷酸序列分析,還能夠獲得有關不同菌株之間差異的豐富信息,可以為進一步深層次的研究提供線索。Nested-PCR技術的靈敏度高,假陰性少,是其他常規檢測萊姆病螺旋體感染方法(如:IFA,EL ISA,WB)所無法比擬的〔14〕。但是Nested-PCR最大的缺點是容易污染,由于DNA擴增效率高,微量的污染即可變成陽性。只要操作者能創造一個超凈的環境,認真仔細操作,Nested-PCR擴增過程中的污染問題是可以避免的。

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Rats,the primary reservoir hosts of Borrelia burgdor feri,in six representative provinces,China

HOU Xue-xia,GENG Zhen,HAO Qin,ZHANG Yang,WAN Kang-lin
(Institute of Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention/State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control,Beijing 102206,China)

The objective of this study was to understand the status of rats,the reservoir hosts of Borrelia burgdorferi,in the six rep resentative provinces in China including Jilin,Shanxi,Gansu,Qinghai,Guizhou and Hunan.The rats were catched in two different areas in each p rovince and the pathogens were isolated and cultured.Nested-PCR was used to test Borrelia burgdorferi in spleen,kidney and bladder of rats.The sequence analysis was used to identify the genotype.Results indicated that two strains of Borrelia burgdorferi wereobtained from apodemus in Guizhou;the specific fragments of Borrelia burgdorferi were obtained in spleen and kidney of rats from all representative provinces in China expect Guizhou;the PCR positive ratewas higher in Huangnan(28.85%)and Shimen(19.6%);therewere statistical differences in theareas.The sequenceanalysis show s that the genotype in Jilin,Qinghai,Gansu and Shanxibelongs to Borrelia garinii,and in Hunan belongs to Borrelia valaisiana.The results indicated that there were different infection rate in rats infected in the six provinces,thus further investigation should conduct for the primary reservoir hosts and for the pathogens carrying situation in different areas of China.

Lyme disease spirochetes;reservoir hosts

R377

A

1002-2694(2010)11-1034-03

萬康林,Email:klwan1217@163.com

中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所 傳染病預防控制國家重點實驗室,北京 102206

2010-05-25;

2010-09-16