嗜酸乳桿菌對球形幽門螺桿菌的細胞黏附和增殖作用的影響＊

吳小茜,佘菲菲,李 能,鄭秀芬,陳月秀

嗜酸乳桿菌對球形幽門螺桿菌的細胞黏附和增殖作用的影響＊

吳小茜,佘菲菲,李 能,鄭秀芬,陳月秀

目的 研究球形幽門螺桿菌(H p)對AGS細胞的黏附和增殖作用及熱滅活狀態和活菌狀態嗜酸乳桿菌對其產生的影響。方法制備AGS細胞爬片,按球形 H p對照組、球形 H p與活/滅活嗜酸乳桿菌實驗組加入細菌,電鏡、革蘭染色后光鏡觀察 H p對AGS細胞黏附指數,同時用熒光抗體染色法評價黏附于AGS細胞的 H p密度。運用CCK-8比色法檢測球形 H p對AGS細胞的增殖影響及比較加入嗜酸乳桿菌產生的變化。結果實驗組與對照組比較,球形 H p對細胞的黏附指數及黏附密度均明顯下降(P<0.05)。低濃度的球形 H p促進細胞增殖,高濃度的球形 H p抑制細胞增殖。兩種不同狀態的嗜酸乳桿菌均能降低 H p對AGS細胞增殖的影響。結論球形 H p對AGS細胞具有黏附能力并隨濃度不同對其產生不同增殖影響,嗜酸乳桿菌能降低其作用。

嗜酸乳桿菌;球形幽門螺桿菌;黏附;增殖

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H p)存在二種形態,螺旋野生形和球形變異形。有證據支持球形 H p在細菌的傳播、致病甚至致癌潛能上起作用。嗜酸乳桿菌作為益生菌,其抗炎、抗腫瘤的作用日益得到重視。本實驗擬從研究球形 H p對胃上皮細胞的黏附和增殖作用及嗜酸乳桿菌對其產生的影響入手,求證球形 H p在 H p感染的病因學與流行病學中的作用并初步探討將嗜酸乳桿菌推廣作為H p感染預防、治療的常規輔助手段的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養 嗜酸乳桿菌標準株6075購自CICC(中國工業微生物菌種保藏中心)。H p國際標準株NCTC11637為本系保存。

1.1.1 嗜酸乳桿菌的制備 采用MRS液體培養基在普通氣體環境下37℃靜止培養36 h,收集菌液分為活菌和滅活二組,滅活組經75℃水浴滅活30 min。以無血清無雙抗的 F12高糖培養液重懸,調整細菌濃度為2×108CFU/m L。

1.1.2 球形 H p的制備 將 H p傳代后再培養2d,用布氏肉湯(含10%小牛血清)洗下細菌,制成菌懸液。加入滅滴靈(終濃度16μg/m L),37℃微氧環境培養,直至 H p全部轉為球形(約48h)。經顯微鏡下觀察及再培養無菌生長,確定為 H p已完全球變。以無血清無雙抗的F12高糖培養液重懸,調整細菌濃度為2×108CFU/m L。

1.2 細胞培養 人胃上皮腺癌細胞系AGS細胞由本系保存,培養液為含10%胎牛血清的F12高糖培養液(含10%胎牛血清,青霉素200 IU/mL,鏈霉素50μg/m L)。置于體積分數為0.05的CO2培養箱中培養,隔天傳代,實驗所用細胞均處于對數生長期。

1.3 細胞爬片制備 于6孔板內置蓋玻片,每孔接種1×105個/m L密度的A GS細胞液2 m L,過夜培養,制成爬片。

1.4 球形 H p對AGS細胞的黏附作用及嗜酸乳桿菌對其影響研究。

1.4.1 電鏡、光鏡觀察分析球形 H p對A GS細胞的黏附情況及嗜酸乳桿菌對其產生的影響 將球形H p(對照組)、球形 H p加活/滅活嗜酸乳桿菌(實驗組)分別加入6孔培養板中,在37℃,體積分數為0.05的CO2環境中與AGS細胞作用2 h。2 m L菌液/孔,調整每孔中嗜酸乳桿菌及 H p菌量分別達到108個。PBS洗3次,革蘭染色后油鏡下觀察并隨機計數50個細胞球形 H p的黏附數量。推算出每個上皮細胞的粘附指數:粘附指數=粘附球形 H p數/細胞數。

同樣處理的細胞爬片,制成電鏡樣本在飛利浦EM 208型透射電鏡下觀察、攝影〔1〕。

1.4.2 熒光抗體染色法定性及半定量評價嗜酸乳桿菌的加入對球形 H p黏附細胞的密度影響 將制備的細胞爬片分組:球形 H p組、空白對照組、球形H p加活/滅活嗜酸乳桿菌組。在37℃,體積分數為0.05的CO2環境中與AGS細胞作用2 h。2 m L液體/孔,除空白對照孔加2 mL無血清 F12高糖培養液外,調整其余各組每孔中嗜酸乳桿菌及 H p菌量分別達到108個。PBS洗3次,兔抗11637多克隆抗體(教研室自備)37℃作用30 min,PBS洗3次,用FITC標記的羊抗兔抗體(購自武漢博士德生物工程有限公司)作用30 min,經洗滌封片后于熒光顯微鏡下觀察并拍照。使用 ImagePro Plus4.5圖像分析系統測定每張熒光照片的總積分光密度值(IOD)。

1.5 CCK-8比色法檢測球形 H p對AGS細胞的增殖影響及加入嗜酸乳桿菌后產生的變化 將1×105/m L的AGS細胞接種于96孔細胞板,100μL/孔,24h后換液,加無血清的F12高糖培養液繼續培養24h,使細胞同步化。待細胞生長至對數生長期,以無血清的F12高糖培養液對新鮮制備菌懸液做倍比稀釋,加入細胞板。實驗分球形 H p組(100μL/孔),球形 H p(50μL/孔)加活/滅活嗜酸乳桿菌(50μL/孔)組。調整每個實驗組球形 H p、活/滅活嗜酸乳桿菌的細菌與細胞比MO I(Multiplicity of infection)初始為2 000∶1。設無細菌無血清細胞培養液處理的細胞組為對照組。每個工作濃度設3個復孔,共培養1d。用 PBS洗滌3遍,每孔加入無血清維持液 100μL,CCK-8試劑10μL。體積分數為0.05 CO2環境中繼續培養3h。室溫避光搖床上充分震蕩10min。選擇450nm波長,在酶標儀上測定各孔吸光度(OD)值。增殖率=(實驗組OD-對照組OD)/對照組OD×100%。

1.6 統計學分析 每次實驗均重復3次。采用SPSS 10.0統計軟件,統計分析的數值以均數±標準差表示,比較分析采用成組 t檢驗和單因素方差分析(one-w ay ANOVA)。

2 結 果

2.1 不同狀態嗜酸乳桿菌對球形 H p細胞黏附指數的影響

2.1.1 不同狀態嗜酸乳桿菌對球形 H p黏附AGS細胞的影響 電鏡及革蘭染色后油鏡下均可見:球形 H p對AGS細胞仍具有較強黏附活性。電鏡下可見AGS細胞的形態結構未發生明顯變化,少數球形 H p可侵入細胞(見圖1),黏附指數為51.46±25.33。存活/滅活嗜酸乳桿菌加球形 H p實驗組(見圖2)黏附指數分別為27.91±11.21/33.27±13.54,較之球形 H p組明顯下降 P<0.05。滅活狀態的嗜酸乳桿菌對球形 H p黏附指數的影響與活菌比P>0.05。

2.1.2 熒光抗體染色法定性及半定量評價嗜酸乳桿菌的加入對不同形態 H p黏附細胞的密度影響熒光顯微鏡下可見,球形 H p能較高密度的黏附于AGS細胞上(見圖 3.1),IOD值:12.4±3.18。存活/滅活嗜酸乳桿菌加球形 H p實驗組中,其 H p的黏附密度有明顯降低(見圖3.2),IOD值分別為3.1±0.91/2.8±0.76,與球形 H p組比較,P<0.05。滅活狀態的嗜酸乳桿菌的加入對球形 H p黏附細胞的密度影響與活菌比無明顯差異 P>0.05。

2.2 CCK-8比色法檢測嗜酸乳桿菌的加入使球形H p對AGS細胞增殖影響產生的變化。

2.2.1 球形 Hp對AGS細胞增殖的影響(表1) 低感染密度狀態下(MOI≤32∶1),實驗組OD值高于對照組(P<0.05),顯示此時球形 Hp具有促進AGS細胞增殖的作用,且其促增殖作用隨著球形 H p濃度的降低而增強。而高感染密度狀態下(MO I≥250∶1),實驗組OD值低于對照組OD值(P<0.05),表明此時球形 Hp具有抑制AGS細胞增殖的作用,且隨著感染密度的增加,抑制作用逐漸增強。

2.2.2 嗜酸乳桿菌的加入使球形 H p對A GS細胞增殖影響產生的變化(表2) 與球形 H p實驗組相比,活性和滅活狀態的嗜酸乳桿菌的加入均能使同一MO I的球形 H p對AGS細胞的促增殖或抑制增殖的作用明顯減弱(P<0.05)。同一MO I時,加入兩種狀態嗜酸乳桿菌的球形 H p實驗組間的OD值無明顯差異(P>0.05)。

表2 CCK-8比色法檢測嗜酸乳桿菌的加入使球形 H p對AGS細胞增殖影響產生的變化Table 2 Detected the change of effect of coccoid H p on the growth of AGS cells by adding the inactivator or living Lactobacillus acidophilus by CCK-8 assay

圖1 電鏡下球形 Hp組↑球形 H pFig.1 Transm ission electron m icrograph of AGScellsadhered by coccoid H p(×12500)

圖2 光鏡下球形 Hp競爭實驗組?嗜酸乳桿菌Fig.2 The effect on adherence of coccoid H p to AGScells by Lactobacillus acidophilus under m icroscope(×1000)

圖3 嗜酸乳桿菌對球形 Hp黏附細胞的密度影響(×400)圖3.1 球形 H p對照組;圖3.2球形 H p+嗜酸乳桿菌組Fig.3 The effect on the density of the adhered coccoid H p by Lactobacillus acidophilus(×400)

3 討 論

球形 H p被傾向于認為是 H p的休眠方式,毒力和活性減弱,在條件適宜時轉化為螺旋形而致病。故而其在 H p感染的致病與流行環節中的作用始終未得到足夠的重視。然而流行病學調查顯示:飲用水與 H p感染關系密切,支持 H p經水傳播的觀點〔2-3〕,而 H p在無營養的水中3～4 d后已全部轉變為球形菌〔4〕。有研究顯示抗生素治療后,球形H p在胃中的潛伏〔5〕,是其成為消化性疾病復發的重要原因之一。我們的實驗中,光鏡和電鏡和熒光鏡均顯示:球形 H p具有較強的胃上皮細胞黏附能力。牢固黏附以對抗胃腸道的蠕動是 H p感染的第一步,阻斷外源入侵的球形 H p或治療后球變的H p的黏附,無疑能夠對預防其感染和根除治療起積極作用。值得注意的的是,雖然傳統認為 H p為非侵入性細菌,然而,于東紅等〔6〕發現球形 H p可進入癌細胞,本實驗組既往的研究也證實其能侵入Hep-2細胞〔7〕。本次實驗中,透射電鏡下我們觀察到少數在細胞內的球形 H p,并拍攝到一個正侵入上皮細胞的球形 H p,證實球形 H p能侵入細胞。而針對螺旋形 H p,目前僅見 Oh JD等〔8〕的研究報告:少數的螺旋形 H p能侵入細胞。球形 H p是否獨立于螺旋形 H p具有入侵細胞的侵襲力,胞內寄生的細菌在 H p的感染及免疫上所起的作用值得引起關注和進一步探討。

嗜酸乳桿菌可在胃內常駐,是安全的微生態制劑,其對 H p抗炎抑制作用已有相關報導,但機制至今未明,且研究也局限于螺旋形 H p。

本研究結果顯示:嗜酸乳桿菌加入后,球形 H p對AGS細胞的黏附指數及黏附密度均明顯下降。而活菌狀態的嗜酸乳桿菌與非活菌狀態的嗜酸乳桿菌對黏附指數的影響無明顯差異,推測其主要通過表面結構成分發揮拮抗作用,而不是代謝產物。

Hp被列為人類Ⅰ類致癌原。針對螺旋形 H p展開的體內實驗一致支持其具有促細胞增殖作用,但體外的研究卻結果不一。然而有學者發現,胃癌組織中的 H p通常是以球形菌的形式存在,癌變胃組織中球形 H p的檢出率顯著高于潰瘍病患者〔9〕。提示球形 H p在胃癌的形成中可能比螺旋形 H p起更重要的作用。本研究中顯示:體外實驗中高濃度的球形 H p抑制AGS細胞的增殖,極低濃度時則能明顯的促進AGS細胞的增殖。這與之前我們實驗組用M TT法研究球形幽門螺桿菌對SGC-7901細胞增殖的影響的結果一致〔10〕。預示低濃度球形 H p可能通過促進細胞增殖而在 H p的潛在致癌性上發揮作用。其機制正待進一步的分子水平的研究。

本實驗,隨著熱滅活狀態和活菌狀態嗜酸乳桿菌的加入,可引起其同一濃度下球形 H p抑制細胞增殖或促進細胞增殖效應減小。但兩種不同狀態的嗜酸乳桿菌抑制作用無顯著差異。推測嗜酸乳桿菌對球形 H p對AGS細胞增殖影響主要通過菌體成分誘發。

總之,球形 H p通過其較強的細胞黏附能力和不同濃度時對胃上皮細胞的不同增殖影響而在 H p感染的病因學與流行病學中可能同樣起重要的作用,并從拮抗球形 H p作用的角度驗證了將嗜酸乳桿菌推廣作為 H P感染預防、治療的常規輔助手段的可行性。

〔1〕金麗,鐘秀容,陳蓮云,等.鹿石合劑對缺氧缺血腦損傷新生大鼠海馬神經元超微結構的影響〔J〕.福建醫科大學學報,2008,42(2):96.

〔2〕Baker KH,Hegarty JP.Presence of Helicobacter pylori in drinking water isassociated with clinical infection〔J〕.Scand J Infect Dis,2001,33(10):744-746.

〔3〕Bunn JE,M ac Kay W G,Thomas JE,et al.Detection of Helicobacter pylori DNA in drinking water biofilms:implications for transmission in early life〔J〕.Lett Appl Microbiol,2002,34(6):4540-4544.

〔4〕佘菲菲,朱蘋,史碧山,等.水中幽門螺桿菌的球形變異及其致病力〔J〕.中華微生物學和免疫學雜志,2001,21(4):395-396.

〔5〕Axon AT,Moayyedi P.Eradication of Helicobacter pylori:omep razole in combination with antibiotics〔J〕.Scand J Gastroenterol suppl,1996,215:82-89.

〔6〕于東紅,王啟之,賈繼輝,等.癌組織中幽門螺桿菌球形體的超微結構研究〔J〕.中國人獸共患病雜志,2004,20(3):190-192.

〔7〕佘菲菲,蘇東輝,朱蘋,等.抗生素誘變的球形幽門螺桿菌定居毒力的研究〔J〕.中華消化雜志,1999,19(3).

〔8〕Oh JD,Karam SM,Gordon JI.Intracellular Helicobacter pylori in gastric epithelial p rogenitors〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(14):5186-5191.

〔9〕Chan W Y,Hui PK,Leung KN,et al.Coccoid formsof Helicobacter pylori in the human stomach〔J〕.Am J Clin Pathol,1994,102(4):503-507.

〔10〕陳豪,張靜,佘菲菲,等.球形幽門螺桿菌對 SGC-7901細胞增殖的影響〔J〕.中國微生態學雜志,2004,16(2):78-79.

The effect on cell adhesion and proliferation of coccoid Helicobacter pylori by Lactobacillus acidophilus

WU Xiao-qian,SHE Fei-fei,L INeng,ZHENG Xiu-fen,CHEN Yue-xiu
(Department of Pathogen Biology,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China)

The aim was to investigate the adhesion and proliferation of coccoid Helicobacter pylori(H p)to the AGS cell and the effect of adding inactivated or living Lactobacillus acidophilus.The AGS cell-seeded coverslips were prepared to react with the control group(coccoid H p alone)and the experimental group(coccoid H p combined with inactivated o r living Lactobacillus acidophilus).The changeon adherence index of H p to AGS cells wasob served under transmission electron microscope and microscope after Gram stain.The density of the adhered coccoid H p was evaluated under the fluorescence microscope by using FITC-conjugated antibody.The effect of coccoid H p on the grow th of AGS cells was detected by CCK-8 assay and the changes induced by the inactivated o r living Lactobacillus acido philus were compared.Compared with those in the control group,the adherence index and density of the experimental group were significantly lower(P<0.05).High concentration of coccoid H p could significantly inhibit the proliferation of the AGS cells(P<0.05)and low concentration of coccoid H p could significantly promote the proliferation of the cells(P<0.05).Both inactivated and living Lacto bacillus acidophilus could reduce the effect of coccoid H p on the proliferation of AGScells.Coccoid H p has fairly strong adherence ability to AGScellsand different concentrations of coccoid H p could affect the proliferation of AGS cells.However,both the inactivated and living Lactobacillus acidophilus could reduce these effects.

Lactobacillus acidophilus;coccoid Helicobacter pylori;adherence;proliferation

R378.9

A

1002-2694(2010)11-1021-04

＊福建省教育廳基金(JA 07082)

吳小茜,Email:w xq20044@hotmail.com

福建醫科大學病原生物學系,福州 350004

2010-05-20;

2010-09-26