可溶性腫瘤壞死因子受體II-脂聯素球部融合蛋白的真核表達及生物學活性檢測

陳素云，何秋山，董小巖，吳小兵，高基民1,

1 溫州醫學院 浙江省醫學遺傳學重點實驗室，溫州 325035

2 中國疾病預防控制中心 病毒病預防控制所 病毒基因工程國家重點實驗室，北京 100052

3 南方醫科大學生物技術學院，廣州 510515

4 北京五加和分子醫學研究有限公司，北京 100176

TNFα (腫瘤壞死因子 α) 在許多疾病的病理生理過程中起著重要的介質作用，拮抗 TNFα已經成為治療自身免疫性疾病的新手段[1]。可溶性 TNFR (Soluble TNF receptor，sTNFR) 是腫瘤壞死因子受體胞外區經剪切脫落而成，分為sTNFRI與sTNFRII兩種。它們都能與TNFα結合而拮抗其活性[2]。現已上市用于治療類風濕性關節炎的藥物 Etanercept被認為是一種高效的 TNFα拮抗劑，它是一種融合蛋白，是通過將sTNFRII基因編碼區與IgG的Fc基因編碼區融合并在哺乳動物細胞中表達而成。借助于Fc的二聚化作用使其拮抗 TNFα的能力較相應sTNFR II 單體提高了50~1000倍[3]。由于體內成熟的TNFα主要以三聚體形式存在[4-5]，本研究欲借助脂聯素球部 (Globular domain of adiponectin，gAD)可形成同源三聚體[6]的特性，構建一種可溶性腫瘤壞死因子受體II-脂聯素球部的融合基因，并在無血清懸浮培養的哺乳動物細胞中表達，試圖獲得具有更高比活性和穩定性的TNFα拮抗劑。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌種和細胞

pET24-gAD質粒由南方醫科大學高基民教授課題組提供；pGluc-Basic質粒購自 NEB 公司；Max Efficiency DH5αTM購自Invitrogen公司；pBluescript SK質粒為病毒基因工程國家重點實驗室保存；pAAV2neo質粒、BHK-21S細胞由北京五加和分子醫學研究所提供，BHK-21S細胞已經過無血清懸浮馴化，在有血清存在時表現為貼壁生長，在化學成分限定的無血清培養基LK021中則表現為懸浮生長特性；……