利用Tol2轉座子構建斑馬魚心臟組織特異表達轉基因載體及其表達分析

陳婷芳，羅娜，謝華平，吳秀山，鄧云

湖南師范大學生命科學學院 心臟發育研究中心，長沙 410081

利用Tol2轉座子構建斑馬魚心臟組織特異表達轉基因載體及其表達分析

陳婷芳，羅娜，謝華平，吳秀山，鄧云

湖南師范大學生命科學學院 心臟發育研究中心，長沙 410081

為了制備用于在斑馬魚心臟中特異表達目的基因的轉基因載體，通過分子克隆的方法對能夠在斑馬魚心臟中特異表達EGFP報告基因的Tol2載體進行了改造，在原有的CMLC2啟動子與EGFP編碼區之間插入帶有多克隆位點的IRES序列，獲得pTol2-CMLC2-IRES-EGFP轉基因表達載體，該載體可以實現在同一個啟動子CMLC2的驅動下分別同時表達目的基因和 EGFP；為了驗證該表達載體的有效性，進一步在 CMLC2啟動子與 IRES序列之間插入DsRed-Monome編碼區，利用得到的pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP轉基因載體顯微注射到斑馬魚單細胞期胚胎中進行表達分析，結果表明外源目的基因DsRed-Monome和報告基因EGFP均能以相同的表達模式在斑馬魚心臟組織中特異表達。pTol2-CMLC2-IRES-EGFP轉基因表達載體的成功構建對于建立心臟發育候選基因的斑馬魚轉基因實驗模型具有重要意義。

Tol2轉座子，斑馬魚，轉基因，心臟特異表達

Abstract:In an effort to generate a desired expression construct for making heart-specific expression transgenic zebrafish, a Tol2 plasmid, which can drive EGFP reporter gene specifically expressed in the heart, was modified using subcloning technology.An IRES fragment bearing multiple cloning site(MCS)was amplified directly from pIRES2-EGFP plasmid and was inserted between the CMLC2 promoter and EGFP fragment of the pDestTol2CG vector.This recombinant expression plasmid pTol2-CMLC2-IRES-EGFP can drive any interested gene specifically expressed in the zebrafish heart along with EGFP reporter gene.To test the effectiveness of this new expression plasmid, we constructed pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP plasmid by inserting another reporter gene DsRed-Monome into MCS downstream of the CMLC2 promoter and injected this transgenic recombinant plasmid into one-cell stage embryos of zebrafish.Under fluorescence microscope, both the red fluorescence and the greenfluorescence produced by pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP were detected specifically in the heart tissue in the same expression pattern.This novel expression construct pTol2-CMLC2-IRES-EGFP will become an important tool for our research on identifying heart development candidate genes’ function using zebrafish as a model.

Keywords:Tol2 transposon, zebrafish, transgenesis, heart-specific expression

轉座子作為插入突變源和分子標簽被廣泛應用于基因的分離、克隆以及基因功能分析，利用基因的轉座原理可研究基因的調控模式，可為脊椎動物細胞的分化和發育提供依據[1]。Tol2是近年發現的唯一的天然存在且具有轉座活性的脊椎動物轉座子，存在于中國、韓國、日本等國的一種淡水魚——青鳉Oryzias latipes的基因組中[2]。……