γ-氨基丁酸對人末梢血γ δ T細胞作用的實驗研究

何曉華,劉世育

(江蘇省徐州市第一人民醫院消化內科 221000)

γ-氨基丁酸對人末梢血γ δ T細胞作用的實驗研究

何曉華,劉世育

(江蘇省徐州市第一人民醫院消化內科 221000)

目的研究γ-氨基丁酸(GABA)對人外周血γ δ T細胞的增殖、細胞周期、凋亡的變化、殺傷活性的影響及其可能的作用機制。方法在體外用不同濃度的GABA與人γ δ T細胞作用后,用MT T比色法和流式細胞儀(FCM)以及乳酸脫氫酶(LDH)法分別檢測人γ δ T細胞的增殖能力、T細胞周期、凋亡和殺傷活性的變化。結果GABA能顯著抑制γ δ T細胞的生長(P＜0.01),并具有濃度依賴性;GABA顯著影響細胞周期比例的分布,促進細胞凋亡;GABA抑制γ δ T細胞對人胰腺癌細胞株SW-1990的殺傷活性。結論GABA能顯著抑制γ δ T細胞的增殖,抑制γ δ T細胞的殺傷活性。提示GABA可能是通過影響細胞周期及凋亡對γ δ T細胞發揮作用,進而影響其殺傷活性。

γ-氨基丁酸;γ δ T 細胞;凋亡;殺傷活性

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是中樞神經系統一種主要的抑制性神經遞質,它不僅存在于中樞神經系統中,而且廣泛存在于外周神經組織及非神經組織細胞中[1]。有研究發現,免疫系統的許多淋巴細胞表達神經活性分子的受體,調節免疫和神經系統之間的相互作用。最近研究證實,CD4+和(或)CD8+T淋巴細胞上表達GABAA受體,GABA與其A受體結合能夠抑制抗原特異性T細胞活化,具有免疫抑制作用[2]。然而,對于 T細胞的另一亞群γ δ T細胞與神經系統之間的相互作用的研究較少。γ δ T細胞是固有免疫的一個重要細胞群,它廣泛分布于消化系統和呼吸系統上皮組織內,末梢血中也有一定的數量。自從1990年Zocchi等[3]首次從2例肺癌患者的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)中分離出γ δ T細胞,并觀察到對自體腫瘤細胞有較強的殺傷性之后,又有文獻報道γ δ T細胞對許多腫瘤細胞系的殺傷作用[4-5]。本實驗應用GABA作用于人γ δ T細胞,研究其對細胞增殖、細胞周期和對 SW-1990人胰腺癌細胞的殺傷活性的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI1640干粉為Gibco公司產品,人AB型血清購自徐州市血站,胎牛血清和淋巴細胞分離液購自中國科學院血液學研究所,Hepes(Amersham公司產品)購于天來生物醫學科技有限公司,異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)、GABA、四甲基偶氮唑藍(MT T)、二亞甲砜(DMSO)均購自Sigma公司,IL-2購于廈門特寶生物工程股份有限公司,SW-1990人胰腺癌細胞株購于中國科學院上海細胞生物學研究所。流式細胞分析儀(TACS Calibur)為美國 BECTON DICKINSON公司產品,恒溫CO2培養箱(Heraeuas公司)、倒置顯微鏡為德國Wilovert公司產品,SEAC全自動酶免系列分析儀和配套的LDH試劑盒為北京希亞克技術有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 γ δ T細胞的培養及收集 取健康獻血者末梢抗凝血10 mL,加入淋巴細胞分離液,以 2 000 r/min離心15 min,吸取單個核細胞層,用生理鹽水洗滌3遍(1 500 r/min離心,每次10 min),加入 RPMI1640培養液中(含10%小牛血清、5%人AB血清),IPP 3 ng/mL和 IL-2 100 IU/mL,調整細胞數為1×108/L,置75 cm2細胞培養瓶中,于37℃、50 mL/L CO2培養箱中培養,根據細胞生長情況及時添加培養液。取細胞培養瓶以1 500 r/min離心5～ 6 min,棄上清液,收集培養的 γ δ T細胞加入新鮮的RPMI1640培養液配成所需濃度的細胞懸液備用。

1.2.2 SW-1990胰腺癌細胞培養 將人SW-1990胰腺癌細胞株置含10%的小牛血清RPM I-1640培養液中,于37℃、5%CO2條件下培養,細胞貼壁生長良好,每2～3天傳代1次。

1.2.3 M TT法檢測 GABA和 PTX對γ δ T細胞增值的影響實驗分為不同濃度的GABA組和對照組。GABA的濃度為10、100、200、400、800、1 600、3 200 μ mol/L;對照組用等體積的RPM I-1640代替,取剛收集的 γ δ T 細胞配成1×105/mL,分別接種于96孔板中,每孔0.2 mL,加入不同濃度的GABA,每組設3個復空,于37℃、50 mL/L CO2培養箱中培養,每2天半量換培養基及加入相對等的藥物,繼續孵育10 d后每孔加入MTT液20 μ L,37℃孵育 4 h后棄上清液,每孔加入 DMSO 150 μ L,輕輕振蕩10 min使甲瓚充分溶解,在 540 nm 波長酶標儀上測定各孔光密度(OD)值,求其平均值;同時計算細胞增殖抑制率。

1.2.4 GABA對γ δ T細胞凋亡和細胞周期影響的檢測 收集γ δ T細胞,1 500 r/min離心5 min,70%冷乙醇固定,離心后加入PI染液1 mL(生理鹽水 129.6 mL,PI 100μ g,RNA酶 2 mg,Triton-X-100 1 mL,枸櫞酸鈉 200 mg,加雙蒸水至200 mL)4℃避光染色30 min,用流式細胞儀檢測,每個樣本分析10 000個細胞。

1.2.5 LDH 法檢測GABA對γ δ T細胞殺傷SW-1990胰腺癌細胞活性的影響 將SW-1990胰腺癌細胞用RPMI-1640培養基培養至對數增殖期,收集細胞用 Hank′s液洗2次,配成2×105/mL;效應細胞(γ δ T)配成 2×106/mL,將效、靶細胞數按10∶1比例混合。無菌塑料管3支各加入胰腺癌細胞懸液0.5 mL。測定管加入經GABA作用的γ δ T細胞懸液0.5 mL。對照組用未經GABA作用的γ δ T細胞,設靶細胞自然釋放管(SW-1990細胞加0.5%BSA-RPMI-1640 0.5 mL)及最大釋放管(SW-1990細胞加 1%NP400.5 mL),每組設 4管。以 500 r/min離心 5 min,置37℃5%CO2培養箱中孵育 5 h后,輕輕混勻細胞,再以1 500 r/min離心 10 min。收集上清液,用 Encore全自動生化分析儀,測定 LDH 的活性單位(u/L)。γ δ T細胞殺傷活性=(測定管 LDH單位-靶細胞自然釋放 LDH單位)/(最大釋放管LDH單位-靶細胞自然釋放管LDH單位)×100%。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件,數值以±s表示,采用兩組均數t檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 GABA對γ δ T細胞增殖的影響 GABA能顯著地抑制γ δ T細胞的生長(P＜0.01),呈劑量依賴性,見表 1。

表1 GABA對γ δ T細胞生長的影響(n=3)

2.2 GABA對γ δ T細胞凋亡和細胞周期影響的檢測 GABA能顯著促進γ δ T細胞的凋亡,細胞凋亡比例從 14.84%到35.46%。隨著藥物濃度的增高,G0/G1期細胞比例逐漸增加,G2/M、S期細胞比例逐漸下降,呈劑量依賴性(P＜0.05),見表2。

2.3 GABA對γ δ T細胞殺傷活性的影響 GABA可以抑制γ δ T細胞對SW-1990胰腺癌細胞株的殺傷活性,呈濃度依賴性(P＜0.01),見圖 1。

表2 GABA對γ δ T細胞周期及凋亡的影響(±s,%,n=3)

表2 GABA對γ δ T細胞周期及凋亡的影響(±s,%,n=3)

與對照組及各濃度組之間比較,#:P＜0.01。

組別 G0/G1 G2/M S 凋亡率對照組(GABA 0 μ mol/L) 38.87±1.38 13.45±0.89 47.67±2.26 14.62±0.60 GABA 200μ M 組 39.43±3.40 10.94±2.45# 49.28±3.77# 14.32±0.34 GABA 800μ M 組 34.75±3.51# 9.63±0.49# 55.62±3.91# 28.99±1.20#GABA 3 200μ M 組 30.04±1.17# 7.30±0.85# 62.65±0.97# 35.39±0.90#

圖 1 GABA對γ δ T細胞殺傷活性的影響

3 討 論

在人類外周淋巴器官及血液中的多數 T細胞屬于α βT細胞,這些α β T細胞來源于骨髓的多能造血干細胞,并且在胸腺中分化為CD4+和(或)D8+T細胞,隨后定居于外周淋巴器官發揮其生物學作用。1984年Saito及其研究小組首次發現在正常外周血淋巴細胞中除了占絕大多數的α βT細胞群之外,還有一群為數只占不到T細胞總數5%的、由γ和δ鏈基因編碼T 細胞受體(TCRs)的T 細胞,即γ δ T 細胞。 與α β T 細胞不同,γ δ T細胞主要分布于皮膚、肺、腸、生殖泌尿道等器官。多年來的研究發現,γ δ T細胞在抗炎癥、抗病原體、抗腫瘤等方面發揮了巨大的作用[6]。國內以往在體外培養擴增γ δ Σ細胞通常用γ δ TCR單克隆抗體固相包被、結核桿菌低分子多肽抗原誘導、HSP70多肽誘導和磷酸脂配體誘導等方法[7]。作者應用IPP和IL-2共刺激法在體外培養10 d時γ δ T細胞的比率從培養前4.21%升至 70.35%,γ δ T細胞增殖倍數達100倍。此足量的高純度的γ δ Σ細胞基本上滿足了目前研究和臨床應用的需要[8]。

自20世紀90年代以來,越來越多的證據顯示神經遞質受體在非神經組織的表達,就免疫系統而論,盡管巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)、B細胞和自然殺傷細胞(NK)也表達神經遞質受體,但是研究者的興趣大多集中在胸腺細胞和T細胞上。經典神經遞質受體如苯二氮 類受體、乙酰膽堿受體、谷氨酸受體、GABA受體、甘氨酸受體等在CD4+和(或)CD8+T細胞上的表達均有報道,其受體激動劑或拮抗劑對T細胞的分化、成熟及其分泌細胞因子(如 IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、TGF-α)等方面均有不可忽視的影響[9],但是關于γ δ T細胞與神經遞質的相互作用國內外報道較少。

GABA主要有 A、B、C 3種受體亞型,A和C受體是配體門控離子通道超家族(ligand-gated ion channel superfamily)成員,A受體是異聚體Cl-離子通道,可被生物堿、Picrotoxin等阻斷。B受體是七跨膜偶聯G蛋白受體家族,可激活第2信使系統及Ca2+和K+通道。Sabina等[2]最近研究發現人類外周血T細胞上表達GABA受體,并且可以對T細胞發揮一定的調節作用。本實驗用GABA對γ δ T細胞的影響研究表明,GABA可抑制γ δ T細胞的生長,并且在第1天加入GABA 時有作用,當培養7 d加入時卻無此作用。此結果表明GABA對γ δ T細胞增殖的抑制作用是在IPP激活前發生的,對 IPP激活后的γ δ T細胞無明顯作用。

與Tian等[10]報道結果一致,本研究發現 GABA 對γ δ T細胞的細胞周期也有一定的影響。不同濃度GABA作用后,G0/G1期細胞比例明顯上升,G2/M期、S期細胞比例降低,結果提示GABA能夠抑制γ δ T細胞生長,影響細胞周期進程,使γ δ T 細胞停滯在G0/G1期,并且顯著地促進 了 γ δ T 細胞凋亡 。因此,GABA是通過促進細胞的凋亡,影響細胞周期發揮作用的,但不排除通過A、B、C受體或其他途徑實現,其具體機制尚有待于進一步研究。這些實驗結果也從側面反映了γ δ T與α βT細胞之間的相似之處。

γ δ-TCR 和 NKG2D 是 γ δ T 細胞上表 達的主 要與炎 癥 、腫瘤等免疫相關的兩類主要的受體,其殺傷活性與腫瘤細胞表達的配體如MICA/MICB、ULBP1-4等密切相關[11]。對殺傷活性的研究發現,GABA可以抑制γ δ T細胞對 SW-1990胰腺癌細胞株的殺傷,并呈劑量依賴性。此結果表明,γ δ T細胞的殺傷活性可能主要是通過γ δ-TCR介導的,是否也通過 NKG2D等其他途徑目前尚不清楚。至于GABA通過何種途徑影響γ δ T細胞表面受體的表達、如何對腫瘤細胞發揮作用尚須深入的研究。

上述實驗資料表明,GABA對γ δ T細胞的影響可能與多種途徑有關,深入認識其作用和作用機制,對于解釋γ δ T細胞的功能及其與神經遞質間的相互作用具有重要的理論意義和臨床應用價值,而且對于闡明γ δ T細胞對于腫瘤細胞的殺傷活性的臨床作用基礎也具有重要的參考價值。另外還可以為神經、內分泌、免疫系統之間相互作用提供證據。

[1] Watanabe M,Maemura K,Kanbara K,et al.GABA and GABA receptors in the central nervous system and other organs[J].Int Rev Cytol,2002,213:1.

[2] Sabina A,David L,Laughton C,et al.Human peripheral blood mononuclear cells express GABAAreceptor subunits[J].Molecular Immunology,2006,43:1432.

[3] Zocchi MR,Ferrarin M,Rugarli C.Selective lysis of thrautologous tumor by tumor infiltrating lymphocytes from human lung carcinomas[J].Eur Immunol,1990,20:2685.

[4] 陳復興,劉軍權,馮霞,等.人末梢血γ δ T細胞對消化系統腫瘤細胞的殺傷作用[J].世界華人消化雜志,2007,25(5):111.

[5] Kabelitz D,Wesch D,He W.Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology[J].Cancer Res,2007,67:5.

[6] Masanobu N,Tetsuo S,Hiroshi Y,et al.γ δ T cells:firefighters or fire boosters in the front lines of inflammatory responses[J].Immunological Reviews,2007,215:103.

[7] 賀偉鋒,程文廣,胡婕,等.激活后γ δ T細胞迅速增殖分子機制的初步研究[J].重慶醫學,2006,35(24):2224.

[8] 陳復興,劉軍權,馮霞,等.一種體外擴增人γ δ Σ細胞的新方法[J].細胞與分子免疫學雜志,2007,23(7):662.

[9] Kerstin L,Philipp B.Neurotransmitter effects on tumor cells and leukocytes[J].Prog Exp Tumor Res,2007,39:99.

[10]Tian JD,Lu YX,Zhang HW,et al.Kaufman.γ-aminobutyric acid inhibits T cell autoimmunity and the development of inflammatory responses in a mouse type 1 diabetes model[J].The Journal of Immunology,2004,173:5298.

[11]Bauer S.Activation of NK cells and T cells by NKG2D,a receptor for stress-inducible MICA[J].Science,1999,285:727.

Effects of γ-aminobutyric acid on human peripheral blood γ δ T cells in vitro

HE Xiao-hua,LIU Shi-yu

(Department of Gastroenterology,the First People′s Hospital of Xuzhou,Xuzhou,J iangsu221000,China)

ObjectiveTo research the effects of GABA on proliferation,cell cycle,apoptosis,cytotoxicity and possible mechanism of action of human peripheral blood γ δ T cells.MethodsUsed the isopentenyl pyrophosphate(IPP)method to amplify human peripheral blood γ δ T cells in vitro.After different doses of GABA to treat with γ δ T cells,M TT method was used to detect the proliferation of γ δ T cells;And then investigated the cell cycle and apoptosis of γ δ T cells by flow cytometry;Meanwhile,measured to cytotoxicity of γ δ T cells by lactate dehydrogenase method.ResultsGABA could decrease the proliferation of γ δ T cells in a dosedependent manner(P＜0.01).The cell cycle of γ δ T cells was greatly affected by treated with GABA,and the apoptosis was increased.GABA could restraintγ δ T cells killing the SW-1990 cell line.ConclusionGABA may effect on γ δ T cells through cell cycle and apoptosis,and then affect the cytotoxicity of γ δ T cells.

γ-aminobutyric acid;γ δ T cells;apoptosis;cytotoxicity

R741.02;R338

A

1671-8348(2010)07-0804-03

2009-08-17

2009-09-28)

?論 著?