血管內皮生長因子-C及其受體在宮頸鱗癌中的表達及意義

周鐵軍,向 麗,龔 莉△,劉 俊

(瀘州醫學院:1.病理學教研室;2.病原生物學教研室,四川瀘州 646000)

血管內皮生長因子-C及其受體在宮頸鱗癌中的表達及意義

周鐵軍1,向 麗2,龔 莉1△,劉 俊1

(瀘州醫學院:1.病理學教研室;2.病原生物學教研室,四川瀘州 646000)

目的研究血管內皮生長因子-C(VEGF-C)及其血管內皮生長因子受體-3(VEGFR-3)在宮頸鱗癌組織中的表達及在淋巴道轉移中的作用。方法采用免疫組化法檢測62例宮頸鱗癌及宮頸上皮內瘤變組織中VEGF-C及VEGFR-3的表達,AE1/AE3檢測盆腔淋巴結微轉移。結果免疫組化AE1/AE3檢測淋巴結轉移檢出率顯著高于HE染色檢出率;宮頸鱗癌中VEGF-C的陽性表達率與宮頸上皮內瘤變(CIN)Ⅰ、CINⅡ的陽性表達率差異有統計學意義(P＜0.05),與CINⅢ無明顯差異;VEGFR-3陽性淋巴管數顯著高于宮頸上皮內瘤變;VEGF-C表達與VEGFR-3陽性淋巴管數呈明顯正相關;VEGF-C及VEGFR-3均與淋巴結的轉移有關。結論AE1/AE3檢查有利于發現淋巴結微轉移;VEGF-C可能通過促進淋巴管的生成,從而利于宮頸鱗癌的浸潤轉移。

宮頸鱗癌;血管內皮生長因子-C;血管內皮生長因子受體-3;淋巴道轉移

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,主要通過淋巴道轉移。淋巴結的轉移是影響宮頸癌患者預后的重要指標。因此,探討宮頸癌淋巴道轉移的機制,對判斷預后及提高治療效果具有重要的意義。血管內皮生長因子-C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)是重要的淋巴管生長因子,可通過調節血管內皮生長因子受體-3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3)的表達,促進淋巴管生成。但宮頸鱗癌及宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)組織中是否有新生淋巴管形成及其功能尚存在分歧。本研究擬通過檢測宮頸鱗癌及CIN組織標本中VEGF-C及VEGFR-3的表達情況及與淋巴結轉移的關系,探討其與宮頸鱗癌淋巴結轉移的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集瀘州醫學院附屬醫院病理科2008年1～12月行宮頸鱗癌活檢及手術切除的62例(38例為根治標本)患者存檔石蠟標本,選取55例宮頸上皮內瘤變組織的石蠟標本(其中CINⅠ15例、CINⅡ15例、CINⅢ25例)。資料保存完整,所有病例均為首次發病,術前均未接受放療、化療。患者年齡27～76歲。38例根治標本中有淋巴結轉移17例,無淋巴結轉移21例。所有標本均經 10%甲醛固定,石蠟包埋,4 μ m連續切片。選取常規HE染色檢測陰性的盆腔淋巴結,檢測腫瘤微轉移情況。

1.2 試劑及方法 采用免疫組化SP法,即用型兔抗人多克隆抗VEGF-C抗體、兔抗人VEGFR-3多克隆抗體、鼠抗人單克隆廣譜細胞角蛋白AE1/AE3抗體、SP試劑盒、DAB顯色劑均購自北京中杉公司。嚴格按試劑盒說明書方法染色,所有切片染色均在相同條件下進行。用PBS液代替一抗做陰性對照,用已知陽性結腸癌組織切片做VEGF-C陽性對照,乳腺癌組織做VEGFR-3陽性對照,宮頸鱗癌組織做AE1/AE3陽性對照。

1.3 結果判斷 所有免疫組化染色結果均由兩位病理醫師在不知病例資料的情況下盲法閱片判斷。VEGF-C的陽性表達位于胞漿或胞膜染呈淡黃色至棕褐色。按染色著色深淺打分:無顯色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。按陽性細胞率打分:陰性為0分,陽性細胞率小于或等于10%為1分,11%～50%為2分,≥51%為3分。染色強度與陽性細胞率的乘積:0～2分為(-),3～4分為(+),5～7分為(++),8～9分為(+++)。VEGFR-3陽性淋巴管判斷標準及記數方法:低倍鏡下尋找VEGFR-3陽性淋巴管密集區,即“熱區”,100倍視野計數10個熱區中VEGFR-3陽性淋巴管數,取平均值。腫瘤區內單個或成叢的內皮細胞,不管成腔與否均視為淋巴管并計數,凡伴有肌層的淋巴管不予計數。AE1/AE3主要定位于細胞漿和細胞膜,出現清楚的棕褐色顆粒者為陽性細胞。

1.4 統計學方法 應用SPSS11.5統計軟件進行分析。根據不同的數據類型選擇不同的統計方法:計量資料結果以x±s表示,計量資料兩組間比較采用兩樣本間t檢驗;計數資料組間采用χ2檢驗;兩個變量相關性采用Spearman′s等級相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 VEGF-C及VEGFR-3在不同組織中的表達情況VEGF-C主要表達于癌細胞胞漿中,呈黃色或棕黃色(圖1),在少數病例中間質細胞也有少量表達。從CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ到宮頸鱗癌組織,VEGF-C的表達強度和表達率逐漸升高,其表達率分別為 33.33%、40.00%、56.00%和 69.35%。VEGF-C在CINⅠ、CINⅡ的表達率分別與宮頸鱗癌比較差異有統計學意義(χ2=6.675,P=0.010;χ2=4.498,P=0.034);而CINⅢ與宮頸鱗癌比較差異無統計學意義(P＞0.05);CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ之間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。VEGFR-3陽性染色為胞漿或胞膜呈明顯的棕黃或棕褐色,主要位于上皮下的淋巴管內皮細胞,管腔多為單層,壁薄,腔內偶見血細胞,腫瘤細胞偶見弱陽性反應,在癌周組織中,陽性反應較強,染色管腔增加,呈局灶性或散在分布(圖2)。從CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ到宮頸鱗癌組織,VEGFR-3陽性表達的淋巴管數逐漸升高,分別為2.93±1.39、3.47±1.68、4.04±1.95和5.26±2.39。VEGFR-3在 CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ的表達分別與宮頸鱗癌比較差異有統計學意義(t=3.614,P=0.001;t=2.739,P=0.008;t=2.263,P=0.026)。其他各組之間差異無統計學意義(P＞0.05),見表1。

表1 不同組織中VEGF-C、VEGFR-3的表達情況

2.2 AE1/AE3的表達及淋巴結轉移情況 AE1/AE3陽性部位主要在細胞漿,微轉移灶表現為單個散在和2～3個及數個聚集成小團狀的癌細胞呈較強的胞漿著色(圖3)。38例患者共檢出淋巴結263枚,常規HE染色發現淋巴結轉移癌29枚,占所檢淋巴結12.17%;陰性淋巴結經免疫組化AE1/AE3復檢發現微轉移癌16枚,占陰性淋巴結6.84%;淋巴結轉移檢出率提高到17.11%,二者之間的差異有統計學意義(χ2=4.026,P=0.045)。

2.3 VEGF-C、VEGFR-3的表達與淋巴結轉移的關系 在宮頸鱗癌組織中VEGF-C的表達與盆腔淋巴結轉移密切相關,有淋巴結轉移組VEGF-C的表達陽性率為82.35%,無淋巴結轉移組為47.62%,兩組比較差異有統計學意義(χ2=4.871,P=0.027);VEGFR-3在宮頸鱗癌組織中的陽性淋巴管數與淋巴結轉移有關,有淋巴結轉移組淋巴管數量明顯高于無淋巴結轉移組,分別為 5.81±2.69和4.17±1.74,差異有統計學意義(t=-2.518,P=0.038),見表2。

表2 VEGF-C、VEGFR-3的表達與淋巴結轉移的關系

圖1 VEGF-C在宮頸鱗癌中的表達(SP×200)

圖2 VEGFR-3在宮頸鱗癌中的表達(SP×200)

圖3 AE1/AE3淋巴結中的表達(SP×200)

表3 VEGF-C的表達與淋巴管生成的相關性

2.4 VEGF-C的表達與淋巴管生成的相關性 在宮頸鱗癌組織中,隨著VEGF-C表達水平增高,VEGFR-3陽性淋巴管數也明顯增加,而VEGF-C表達陰性者,VEGFR-3陽性淋巴管數明顯減少,Spearman′s相關分析發現,二者之間呈明顯正相關(r=0.432,P=0.000),見表 3。

3 討 論

淋巴結微轉移是指直徑小于2 mm的癌轉移灶,在常規HE切片中不易發現[1]。近年研究表明,即使常規病理檢查無淋巴結轉移的宮頸癌患者,仍有約10%的患者術后較快出現復發和淋巴結轉移,這可能與癌細胞微轉移有關[2]。廣譜細胞角蛋白AE1/AE3廣泛表達于上皮組織中。本研究中,AE1/AE3染色總共檢測到微轉移淋巴結16枚,占陰性淋巴結的6.84%,轉移淋巴結的檢出率由HE染色的12.17%提高到AE1/AE3染色的17.11%,二者間差異有統計學意義(χ2=4.026,P=0.045),說明運用免疫組化技術檢測淋巴結中AE1/AE3的表達有利于提高宮頸鱗癌淋巴結轉移檢出率。

腫瘤治療失敗的一個重要原因是腫瘤細胞易從原發部位通過血管、淋巴管向其他器官擴散,從而導致患者死亡,因此腫瘤轉移是惡性腫瘤的重要生物學特性。多數上皮源性的惡性腫瘤主要以淋巴道轉移為主,而淋巴結轉移是一個極其復雜、連續的過程,其中淋巴管和微血管在腫瘤生長轉移過程中起著重要作用。VEGF-C是近年來第一個被發現的具有淋巴管生成作用的VEGF家族新成員,又稱淋巴管生長因子,在人類基因中定位于染色體4q34。它通過產生特異性的新生淋巴管刺激因子,具有刺激血管和淋巴管生成的雙重作用;通過與其特異性受體結合,引起一系列的信號轉導,在多種腫瘤的生長、發展及轉移中起著重要的調節作用[3-4]。

VEGFR-3屬于酪氨酸激酶超家族成員,是一種高度糖基化的單鏈跨膜鑲嵌蛋白,是胚胎血管形成的必要因素,在血管、淋巴管內皮細胞都有分布,在胚胎后期,VEGFR-3分布逐漸限于淋巴管,血管中幾乎不表達,其主要參與淋巴管的形成。成人VEGFR-3主要分布于淋巴管內皮細胞,因此認為其是淋巴管內皮特異性標志物。VEGFR-3與配體結合可引起內皮細胞增殖和遷移、調控血管和淋巴管內皮細胞的新生,對胚胎發育及腫瘤的生長和轉移起重要作用。VEGFR-3在淋巴管內皮上的表達程度可反映腫瘤間質中淋巴管增生的程度[5]。

目前有關VEGF-C調節血管和淋巴管的機制尚不清楚。認為VEGF-C是以配體的形式與兩個酪氨酸激酶受體VEGFR-2和VEGFR-3結合發揮作用,前者主要分布于血管內皮細胞上,后者在血管及淋巴管內皮細胞都有分布。有研究發現VEGF-C能提高血管的通透性,結合并激活VEGFR-3,通過蛋白激酶C依賴的P42/44促分裂原活性蛋白激酶(mitogen actived protein kinase,MAPK)和磷酸肌醇-3激酶(PI3K)/絲-蘇氨酸激酶(Akt)信號傳導通路促進淋巴管內皮的存活與增殖[6],甚至VEGF-C信號僅單獨由VEGFR-3傳遞就足以造成淋巴管的增生。

本研究表明,從CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ到宮頸鱗癌,VEGFC表達逐漸增強,差異有統計學意義(P＜0.05),這與Van Trappen等[7]的研究基本一致。而且在宮頸鱗癌的發生中,淋巴管發生表型改變可在宮頸上皮內瘤變中出現。超過50%的CINⅢ級的病例中在其基底膜下有VEGF-C及其受體的高表達。相反,在CINⅠ和CINⅡ中沒有或很少有VEGF-C的表達。結果提示VEGF-C可以通過激活其受體VEGFR-3誘導腫瘤附近淋巴管生成從而促進局部淋巴結轉移,而VEGF-C表達的關鍵取決于CINⅢ是否向侵襲性疾病進一步發展,一旦發生浸潤性癌將誘導腫瘤早期向淋巴結轉移。

從CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ到宮頸鱗癌,隨著 VEGF-C表達的增強,VEGFR-3陽性表達的淋巴管數也逐漸增強,二者呈明顯正相關關系(r=0.432,P=0.000)。這與楊增周等[8]在食管鱗癌中的研究基本一致。超過50%的CINⅢ病變中出現淋巴管,然而在CINⅠ、CINⅡ病變中這種現象并未出現。在宮頸鱗癌中,腫瘤附近出現的淋巴管更加明顯,且在這些腫瘤中出現中至高VEGF-C的表達,這就可以解釋為什么早期子宮頸鱗癌有淋巴結微轉移。同時本研究發現,VEGF-C在淋巴結轉移組的陽性率明顯高于無轉移組;VEGFR-3陽性淋巴管數在淋巴結轉移組較無轉移組明顯增多,差異有統計學意義(P＜0.05)。而且淋巴結轉移數越多VEGF-C的表達越強,腫瘤附近的淋巴管也越多,這與王金衛和張筱驊[9]在甲狀腺乳頭狀癌中的研究一致。提示VEGF-C可能通過其刺激受體VEGFR-3的表達,促進腫瘤淋巴管的生成來利于腫瘤的轉移。

在本研究中發現腫瘤附近的血管少部分也表達VEGFR-3,說明VEGFR-3在標記淋巴管時不具有特異性,這可能是本研究和其他研究不一致的原因。同時本研究發現在部分腫瘤細胞中也表達了VEGFR-3,其具體機制有待進一步的研究。

[1] 沈樑,黃穎烽,梁柳森,等.甲狀腺癌前哨淋巴結微轉移分子檢測及其臨床意義[J].臨床醫學,2008,28(11):98.

[2] Stolze IP,Mole DR,Ratcliffe PJ.Regulation of HIF:prolyl hydroxylases[J].Novartis Found Symp,2006,272(1):15.

[3] Takahashi M,Yoshimoto T,Kubo H.Molecular mechanisms of lymphangiogenesis[J].Int J Hematol,2004,80(1):29.

[4] Su JL,Yen CJ,Chen PS,et al.The role of the VEGF-C/VEGFR-3 axis in cancer progression[J].Br J Cancer,2007,96(4):541.

[5] Salameh A,Galvagni F,Bardelli M,et al.Direct recruitment of CRK and GRB2 to VEGFR-3 induces proliferation,migration,and survival of endothelial cells through the activation of ERK,AKT,and JNK pathways[J].Blood,2005,106(10):3423.

[6] Makinen T,Veikkola T,M ustjoki S,et al.Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth,survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3[J].EM BO J,2001,20(17):4762.

[7] Van Trappen PO,Steele D,Lowe DG,et al.Expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)-C and VEGFD,and their receptor VEGFR-3,during different stages of cervical carcinogenesis[J].J Pathol,2003,201(4):544.

[8] 楊增周,席鴻鈞,侯進榮.血管內皮生長因子-C及血管內皮生長因子受體-3在高發區食管鱗癌淋巴結轉移中的作用[J].新鄉醫學院學報,2008,25(1):15.

[9] 王金衛,張筱驊.甲狀腺乳頭狀癌淋巴管生成與淋巴結轉移、血管內皮生長因子-C表達的關系[J].浙江醫學,2008,30(6):548.

Expressions of vascular endothelial growth factor-Cand its receptor in cervical squamous cell carcinoma and their role in lymph metastasis

ZHOU Tie-jun1,XIANGLi2,GONG Li1△,et al.
(1.Department of Pathology,2.Department of Medical Microbiology andParasitology,Luzhou Medical College,Luzhou646000,China)

ObjectiveTo study the expressions of VEGF-C and its receptor VEGFR-3 in cervical squamous cell carcinoma tissues,as well as their roles in lymph metastasis.MethodsSixty-two cases of cervical squamous cell carcinoma and cervical intraepithelial neoplasia were detected by immunohistochemical staining(S-P)for the expressions of VEGF-C,VEGFR-3 and tested the expression of AE1/AE3 in lymph node to explore lymph metastasis.ResultsThe positive rates of AE1/AE3 by immunohistochemical staining in lymph nodes of cervical carcinoma were all more than those of routine H-E staining.The difference of positive expressive rate of VEGF-C between the cervical squamous cell carcinoma and CINⅠ,CINⅡwas statistically significant,but not to CINⅢ.The difference between the cervical squamous cell carcinoma and cervical intraepithelial neoplasia in VEGFR-3 expression was statistically significant.The expression level of VEGF-C in cervical squamous cell carcinoma was positively correlated with the positive number of lymphatic vessels stained by VEGFR-3.VEGF-C and VEGFR-3 were all related to lymph node metastasis.Conclusion

The detection of AE1/AE3 may be much easier to find out the LN with micrometastasis;VEGF-C facilitates invasion and metastasis in cervical squamous cell carcinoma by promoting lymphangiogenesis.

cervical squamous cell carcinoma;VEGF-C;VEGFR-3;Lymph metastasis

R737.33;R730.43

A

1671-8348(2010)05-0533-03

△通訊作者,E-mail:scgongli@sina.com。

2009-07-30

2009-09-10)

?論 著?