哺乳動物味覺感受器T1Rs受體家族及信號轉(zhuǎn)導機制的研究進展

單俐敏,張春雷,陳 宏＊,2,房興堂

(1.徐州師范大學細胞與分子生物學研究所,江蘇徐州 221116;2.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院,陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學重點實驗室,陜西楊凌 712100)

味覺是哺乳動物極為重要的感覺,可以感知五種味覺,甜、酸、苦、咸和鮮。味覺的感受部位即味覺細胞,也叫味覺感受細胞(taste receptor cell,TRC),多位于味蕾中央,細胞的游離端呈毛狀突起即微絨毛,微絨毛上存在多種受體。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)咸味和酸味的受體是離子通道耦聯(lián)受體,其他味覺的受體被認為是G蛋白耦聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors,GPCR)。1999年,Hoon.M.A等從多只小鼠的舌頭上提取了一些味覺細胞,在對其進行cDNA文庫的測序時發(fā)現(xiàn)了T1R1基因,選擇性地在味覺細胞中表達。以T1R1基因為基礎的PCR,又鑒定出T1R2基因[1],接著T1R3基因也在人的DNA文庫中被鑒定出來。這三個受體屬于GPCR家族C亞型,即T1Rs家族,其中T1R2+T1R3以異二聚體形式共表達并參與甜味識別,而T1R1+T1R3以異二聚體形式共表達并參與鮮味(氨基酸味)識別。目前關于這個受體家族的研究都集中在小鼠和人上,對牛的T1Rs受體家族的研究還沒有。牛的味覺是很發(fā)達的,口腔內(nèi)味覺細胞多達1.5萬個,比人類有更敏感的味覺感受系統(tǒng),良好的味覺能夠促進牛的食欲,提高采食量,促進生長發(fā)育,所以有必要對這個受體家族做進一步的探索。近十幾年來由于基因組計劃、蛋白質(zhì)組計劃的研究進展迅速,分子生物學、生物信息學、行為學、電生理學等方法的充分利用,對該受體家族的分子機制已取得突破性的進展。本文從甜味和鮮味兩個方面對這一受體家族及信號轉(zhuǎn)導機制的最新研究情況做簡要綜述。

1 哺乳動物T1Rs受體家族

T1Rs家族屬于G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)超家族C亞型成員,這個家族還包括 mGluRs、GABABRs、鈣敏受體、V2R受體等。T1Rs是一類獨具特色的GPCR,它們擁有大的細胞外結(jié)構域,其中包括捕蠅夾域(venusflytrapdomain,VFT),半胱氨酸富集域(cysteine-rich domain,CRD)和七次螺旋跨膜域(heptahelical transmembrane domain,HD)。VFT主要負責配體的識別與結(jié)合,它與細菌中的外周質(zhì)氨基酸結(jié)合蛋白PBP(perplasmic amino acid binding proteins PBP)具有一定的序列相似性[2]。HD有相應的3個細胞內(nèi)環(huán)和3個細胞外環(huán)。細胞內(nèi)環(huán)和它們相應的跨膜區(qū)段高度保守,是G蛋白的結(jié)合位點,而各成員的細胞外環(huán)差異很大,是配體結(jié)合區(qū)。

T1Rs基因家族由T1R1、T1R2和T1R33個基因組成。T1Rs受體以異源二聚體的形式發(fā)揮作用:T1R2和T1R3結(jié)合形成甜味受體(僅表達T1R3受體的細胞也存在,以同型二聚體的形式,但它只是低親和力的糖受體[3,4]);T1R1和T1R3結(jié)合形成鮮味受體。

2 甜味識別依賴的異二聚體膜受體(T1R2+T1R3)

T1R2+T1R3這兩種受體共同形成感受各種糖和人工甜味劑的功能受體。T1R2或T1R3基因單剔除的小鼠對各種人工甜味劑的反應消失,對低濃度糖液的反應強烈降低,但對較高濃度的糖液的反應則是部分降低。然而T1R2+T1R3的基因雙剔除的小鼠對所有測試的不同濃度的糖液的行為學與電生理學反應均會消失。這些實驗證據(jù)表明T1R2和T1R3形成了針對人工甜味劑的功能性受體與高親和力的糖受體,而僅表達其中一種受體的則是作為一種低親和力的糖受體[5]。

人類能感覺到甜味的甜味劑被許多哺乳動物所喜好,但不同的物種對甜味劑的識別不盡相同,如小鼠喜歡糖精、乙?；撬岚封洝⑷日崽呛透仕豙6],但卻感覺不到幾種人工甜味劑(例如:環(huán)已氨磺酸鹽、阿力甜、阿斯巴甜)[7,8]。大鼠的甜味受體對三氯蔗糖反應強烈[9],但大鼠不太喜歡三氯蔗糖和甘素[10,11]。豬不能識別一些人工甜味劑(如索馬甜、環(huán)已氨磺酸鹽、新橙皮苷二氫查耳酮(NHDC)、阿斯巴甜等)。

幾個實驗室利用人類和小鼠對一些人工的或天然的甜味劑的敏感性不同設計了一系列的實驗,利用人鼠嵌合體受體去定位 T1R2+T1R3異二聚體的功能域與一些甜味劑反應的關系。這些實驗大部分利用異源細胞,揭示出人的T1R2的胞外區(qū)是阿斯巴甜和紐甜(neotame)所需[12],人的 T1R3的CRD區(qū)是植物甜蛋白(brazzein)所需[13]。人 T1R3的HD區(qū)是環(huán)已氨磺酸鹽所需[12,14],同時也是NHDC作用位點[15]。利用相似的方法揭示,拉克替醇(甜味抑制劑)是人類 T1R3的HD區(qū)所需[12,16],這個抑制劑就像高濃度的糖精和乙?；撬岚匪徕浺粯邮侨薚1R2+T1R3的反激動劑。轉(zhuǎn)基因表達人T1R2的人化小鼠對阿斯巴甜,莫內(nèi)林和其它甜味劑[4]有反應(但對NHDC沒有反應)。將人的T1R3基因轉(zhuǎn)到nontaster鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)對甜味劑的反應提高了[17],說明T1R3基因與小鼠的sac基因是等同的。貓對任何甜味劑都不喜歡[18],是因為貓的T1R2基因是個假基因,這為 T1R2+T1R3共同起作用提供了支持[19]。

目前T1Rs受體的晶體結(jié)構還沒有得到,所以配體如何結(jié)合并激活受體還不能準確確定,但可以用同源建模的方法從其它已經(jīng)得到的受體的晶體結(jié)構來預測。存在和缺乏配體基的mGluR1 VFT的晶體結(jié)構已經(jīng)得到,T1Rs和mGluRs之間重要的保守結(jié)構表明,mGluRs的VFT的晶體是T1Rs同源建模的合理模板[20]。研究發(fā)現(xiàn)當T1R2的VFT的兩個位點(在mGluRs同系物中是谷氨酸結(jié)合的關鍵位點)發(fā)生突變,對二肽甜味劑的反應就會喪失,但只能部分影響蔗糖[12],說明這兩類小分子甜味劑都結(jié)合在 T1R2的VFD區(qū),但結(jié)合的區(qū)域不同。GPCR視網(wǎng)膜紫質(zhì)A亞型的晶體結(jié)構也已經(jīng)得到,它是T1Rs HD建模的合理模板[15]。T1R3的 HD區(qū)的大范圍誘變揭示HD區(qū)的第三五六環(huán)是環(huán)已氨磺酸鹽,NHDC,和拉克替醇的結(jié)合位點[12,16]。

人和鼠甜味受體的功能學研究表明,拉克替醇能抑制人的T1R2+T1R3異二聚體的活性,但對鼠沒有反應[9],所以Winnig利用定點誘變的方法去研究拉克替醇為什么對鼠的甜味受體不起作用,發(fā)現(xiàn)是T1R3跨膜第五區(qū)的738Val和735Lys造成的(人是738Ala,735Phe),并推測是因為氨基酸的改變引起蛋白質(zhì)的結(jié)構發(fā)生改變,導致拉克替醇很難結(jié)合到它的作用位點上[16]。Alexey等人在對T1R3的多態(tài)性與人對蔗糖的敏感性之間關系的研究中發(fā)現(xiàn)兩個C/T的SNPs,T1R3編碼區(qū)的上游區(qū)域與人的蔗糖敏感性非常相關,利用熒光酶報告分析,這兩個SNPs的結(jié)果表明T與C相比,降低了啟動子的活性,影響基因轉(zhuǎn)錄,啟動子的末端區(qū)域潛伏著復合的順式作用原件,它對啟動子有強沉默作用,得出結(jié)論,這兩個SNPs是通過改變調(diào)節(jié)元件的功能,影響基因轉(zhuǎn)錄。

人類和其它哺乳類動物對甜味劑的喜好不同,利用這些差異已經(jīng)做了很多實驗,也得到了很多信息。但對糖這種哺乳動物都喜歡的甜味劑卻無法檢測。Nie等利用一種光譜學的方法研究了純化的T1R2和T1R3VFD區(qū)與配體的關系。發(fā)現(xiàn)兩個亞基與三種糖(葡萄糖、蔗糖、三氯蔗糖)都能結(jié)合,但親和力不同。

某些甜味劑如糖精鈉和乙酰磺酸胺鉀會產(chǎn)生甜味后覺反應,在低濃度時糖精鈉和乙?；前匪徕浗Y(jié)合到一個高親和力的結(jié)合點上,產(chǎn)生甜味;而在高濃度時,它們會結(jié)合到第二個低親和力的抑制點上,產(chǎn)生苦味。當甜味抑制成分被水洗掉時,甜味受體重新激活,甜味的感覺又回來了。甜味味覺受體并不局限于味覺上皮,T1R2和T1R3也在胃腸道的營養(yǎng)感知細胞中,起到對營養(yǎng)的識別、同化吸收的作用。小鼠β細胞中也存在的一種蛋白質(zhì)和構成舌頭的甜味受體的蛋白質(zhì)的堿基序列完全一樣。

3 鮮味識別依賴的異二聚體膜受體(T1R1+T1R3)

鮮味(氨基酸味)是五種基本味覺之一,主要指谷氨酸鈉(味精)的味道,在1908年被Ikeda.K首次發(fā)現(xiàn),但在最近才被大眾接受作為一種基本味覺。研究發(fā)現(xiàn)許多物質(zhì)具有這種味道,如組成蛋白質(zhì)的20種天然氨基酸,嘌呤核苷酸(如肌苷酸(IMP)、鳥苷酸(GMP))。

不同的物種在味覺感覺上有選擇性和特異性。鼠T1R1+T1R3對20種L-型氨基酸都有反應,但人T1R1+T1R3只選擇性地對谷氨酸鈉(MSG)和天冬氨酸有反應。

T1R1+T1R3能感受天然的20種L-型氨基酸(T1R1+T1R3能識別 L-氨基酸,但不能識別甜-D-氨基酸,如 D-Trp),只有在感知谷氨酸時IMP才對其具有加強作用,這是鮮味的主要特點-協(xié)同作用。鮮味受體和甜味受體共享一個共同的T1R3,但能識別不同的味質(zhì),說明 T1R1和 T1R2的N-末端胞外域決定了鮮甜受體的配體特異性。利用甜-鮮嵌合體,誘變分析和分子建模方法揭示谷氨酸和IMP協(xié)同激活鮮味受體。T1R1的N-末端胞外域是IMP和GMP起加強作用的結(jié)合部位,L-Glu配體結(jié)合到鉸鏈區(qū)(VFD區(qū)中的一小段),5'核苷酸結(jié)合到捕蠅域開口的位點,進一步穩(wěn)定閉合現(xiàn)象,通過延長L-Glu留在受體嘴部的時間從而增強鮮味味覺。

環(huán)已胺基磺酸鹽與人的T1R3的TMD區(qū)起作用,對鮮味和甜味受體有不同的作用,它是甜味受體的激活劑,是鮮味受體的增強劑。最近,一種關于GPCRs的C亞型激活的亞基重排機制被提出,所以Zhang.F等提出環(huán)已胺磺酸鹽誘引T1R3的 TMD的信號改變,導致兩個TMD的亞基重排,可能是這兩種受體的能量障礙不同,所以這種重排只能激活T1R2+T1R3。

4 甜味和鮮味的信號轉(zhuǎn)導機制

為,人和靈長類動物的味覺傳入通路中,孤束核的神經(jīng)元是第二級神經(jīng)元,由孤束核的神經(jīng)元發(fā)出的纖維到丘腦腹后內(nèi)側(cè)核;嚙齒類動物的味覺傳入通路,由孤束核投射到腦橋的臂旁核,由臂旁核中繼后分兩條徑路投射到丘腦的腹后內(nèi)側(cè)核、下丘腦外側(cè)區(qū)、經(jīng)其中繼后投射到皮質(zhì)的中央后回最下部的味覺中樞進行味覺感知。

由于甜味化合物化學構成不同,導致甜味信息的轉(zhuǎn)導有著不同的途徑。甜味在味覺細胞內(nèi)的傳導途徑:蔗糖與特定的GPCR結(jié)合后,結(jié)合GTP的α亞基與腺苷酸環(huán)化酶(AC)結(jié)合,使之活化,并將ATP轉(zhuǎn)化為cAMP,導致胞內(nèi)cAMP濃度升高,進一步激活蛋白激酶A(PKA)磷酸化,然后抑制基底外側(cè)的K+通道,引起胞外Ca2+內(nèi)流。人工甜味劑與另外一種GPCR結(jié)合,激活 PLCβ2,使 PIP2水解成IP3和DG,胞內(nèi)IP3增加,導致胞內(nèi)細胞膜上IP3門控Ca2+通道開放,胞內(nèi)貯存的Ca2+釋放。

味蛋白是一種味覺特異性G-蛋白,專門表達于舌味蕾細胞而不表達于其他細胞,它是苦味傳導中一種重要的蛋白質(zhì)。味蛋白由α-gustducin,Gβ3和Gγ 13共3個亞基組成,α-gustducin基因敲除小鼠的行為測試,味覺神經(jīng)信號記錄顯示α-gustducin參與某些苦味、甜味和鮮味的轉(zhuǎn)導。味蛋白調(diào)節(jié)的味覺轉(zhuǎn)導通路:味質(zhì)與甜/鮮受體結(jié)合,激活α-gustducin-Gβ3-Gγ13三聚體,β和 γ亞基釋放出來激活磷脂酶 C(PLCβ2)產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3),從而引起胞內(nèi)貯存的Ca2+釋放。上述三種途徑釋放的Ca2+會激活TRPM5通道,TRPM5使細胞膜去極化導致ATP釋放,釋放的ATP能激活味覺傳入神經(jīng)細胞上的離子型嘌呤能受體。這個模型被相關信號分子敲除實驗支持。

5 小結(jié)

味覺受體和味質(zhì)(tastant)結(jié)合后,會導致味覺細胞的細胞膜去極化和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。通過這種方式,味覺受體細胞將感受到的化學信號轉(zhuǎn)化為電信號。然后沿著舌咽神經(jīng)、面神經(jīng)的鼓索神經(jīng)側(cè)支和迷走神經(jīng)將信號傳導至延髓孤束核。多數(shù)文獻認

目前對于T1Rs受體家族的研究還有很多不足,T1Rs受體晶體還沒得到,它是系統(tǒng)研究甜/鮮味劑如何結(jié)合并激活其受體的最大障礙。目前的發(fā)現(xiàn)僅僅確認了T1Rs受體家族對甜和鮮味群的識別作用,其轉(zhuǎn)導機制還有賴于更先進、更精確、更敏感的研究方法進一步揭示。味覺傳導的未來發(fā)展方向?qū)⒓醒芯课队X信息在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是如何進行的。隨著對味覺理解的加深,不僅可以通過不同物質(zhì)的組合產(chǎn)生新的可口的味道,提高我們的生活質(zhì)量,而且可以讓有味覺障礙的人也能品嘗到食物的美味。牛的味覺是很發(fā)達的,有比人類更敏感的味覺感受系統(tǒng),但目前對該受體家族的研究主要集中在小鼠和人上,在牛上這方面的研究非常少。良好的味覺能夠促進牛的食欲,提高采食量,促進生長發(fā)育,所以應該加強牛在這個方面的研究。

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