氣管和肺干細胞定位及其分子調控機制

金鑫 石穆穆 李欣 賈心善

1 氣管干細胞的概念及特性

干細胞均有3個特性：干細胞長時期具有分裂和自我更新的能力；干細胞沒有特化功能，即無法特化任何組織特異性結構而能夠行使特定功能；能夠產生特化細胞，這個過程被稱為分化。此外干細胞在組織中為數甚少，而且絕大多數在靜態G0期。有關氣管干細胞有兩種觀點：

1.1 基底細胞干細胞論 基底細胞表達P63及角蛋白5和14（Keratin5/14, Krt5/14）[1-5]。成熟氣管組織中的細胞更新率通常很低[6]，但除纖毛細胞外，氣管上皮損傷能夠引起其他細胞迅速增殖[7]，組織修復的速度很快。Hong等[8]應用譜系追蹤法對經萘損傷表達Krt14-CreER細胞的研究表明，某些基底細胞能夠進行自我更新，并能生成纖毛細胞和分泌細胞。其次，二氧化硫（SO2）吸入法損傷氣管上皮后，部分基底細胞長期保持脫氧尿嘧啶（BrdU）標記[9]。再次，高度表達Krt5-綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的基底細胞具備更大的增殖及體外克隆的能力[3]。另外，移植受體中，分離的小鼠氣管基底細胞可以使受損裸露的氣管上皮細胞恢復完整[10]。因此認為，基底細胞就是干細胞。

1.2 基底細胞祖細胞論 但是也有證據不支持基底細胞就是干細胞的觀點。Evansi等[10]認為，終末細支氣管沒有基底細胞，而可由Clara細胞修復；胎兒期發生過程中，氣管上皮中基底細胞發生于纖毛和粘液細胞之后，氣管柱狀上皮初期形成時基底細胞不是必需的；基底細胞與柱狀細胞的同增減數量比例不恒定；柱狀上皮損傷后，主要反應為粘液細胞而不是基底細胞。此外Avri Delplanqur[11]發現，水道蛋白3（AQP3）可表達于基底細胞，通過流式細胞儀，把AQP3（+）的基底細胞與AQP3（-）的纖毛細胞及粘液細胞分離，此后再分別移植，結果AQP3（+）及AQP3（-）細胞群均能再建假復層纖毛柱狀上皮。由此證明基底細胞與粘液細胞都能進行克隆分化，因而基底細胞不具備特異性。Daniely等[2]在實驗中敲除了基底細胞標記物P63，在P63陰性的胚胎氣管中，基底細胞消失，但纖毛細胞為主的細胞依然存在，由此證明纖毛細胞為主的柱狀上皮細胞不必須由基底細胞轉化而來。基底細胞約占氣管假復層纖毛柱狀上皮的30%，與干細胞所應占據的比例不符；基底細胞表達角蛋白K14、K5，說明其進行了一定程度的分化；宋楠等[12]證明穩態下基底細胞不表達提示未分化的Oct3/4.Sox2.Nanog基因，提示其已有分化；由于非基底細胞群能夠再建假復層纖毛柱狀上皮，因此認為基底細胞為祖細胞，而不是干細胞。同理，纖毛細胞出現纖毛，為終末分化細胞，而粘液細胞分泌粘液，Clara細胞分泌特殊顆粒，II型肺泡上皮細胞含有板層小體，上述細胞都有所分化且具備特異功能，且數量很多，因此認為它們均為祖細胞，而不是干細胞。那么，氣管干細胞存在于哪里？如何證明其存在呢？

2 氣管干細胞的證明方法

2.1 慢性標記細胞（LRC）理論被質疑 Borthwick[9]通過連續在雄鼠氣管內滴注聚多卡醇（polidocanol）或SO2吸入法使氣管上皮受損，同期隔日腹膜內注射BrdU，95天后在小鼠氣管腺導管內發現了慢性標記細胞。排除3天、95天的標記指數（LI）分別為65%、30%。其中，60%慢性標記細胞集中在上段氣管腺導管；其余集中在下段氣管軟骨-軟骨粘膜接合處；多數為基底細胞而少數為纖毛細胞，由此提出慢性標記細胞就是干細胞。

盡管上述觀點曾被許多雜志引用，但由于不能確定小鼠氣管上皮細胞的壽命，故觀察95天后的細胞終究為經過幾次分裂后的子細胞尚屬未知。再者，干細胞所占細胞總數的比例不足10%，那么其中30%的慢性標記細胞中必定混有短暫增殖祖細胞。

2007年，Kiel等[13]在Nature雜志發表論文，否定了通過慢性標記細胞判定干細胞的可靠性，經特征標記高度提純造血干細胞對其進行評估。實驗利用環磷酰胺以及粒細胞集落刺激因子處理新生小鼠，給予正常成熟小鼠BrdU 4天-10天后，停用70天。僅少于6%的造血干細胞保留BrdU，而保留BrdU的骨髓細胞中，造血干細胞不足0.5%。該實驗結果表明：BrdU作為造血干細胞的標記，其特異性和敏感性均很低，能否將其用于氣管干細胞尚須進一步證明。

2.2 在G0期細胞中尋找干細胞 99%的干細胞處于G0期，為什么不在G0期中找尋？5-氟尿嘧啶（5-FU）為抗嘧啶類代謝藥，屬于代謝周期性特異的藥物，可使增殖期的氣管粘膜細胞變性、壞死、脫落，而對G0期細胞并不敏感。2003年，賈心善研究組[14]使用5-FU誘發制成離體大鼠氣管環嚴重損傷的模型，經5-FU作用12 h后的氣管環上皮幾乎全部脫落，殘留間隔分布的裸核樣細胞呈釘狀，位于基底膜上，PCNA染色細胞核均為陰性，證明該細胞為G0期細胞；去除5-FU 3 h-6 h后，上述細胞變為扁平細胞；9 h-12 h后，扁平細胞逐漸轉變為立方上皮；24 h后，可見到纖毛樣結構、粘液分泌[15]；48 h后氣管被假復層柱狀上皮細胞所覆蓋。在5-FU的打擊下，進入細胞周期的氣管粘膜細胞變性、壞死、脫落，初始的基底膜是完整的（經嗜銀染色證明），那么在上皮修復過程中，上皮細胞只能來源于殘留的抗5-FU的G0期細胞。換句話說，干細胞就在其中。筆者認為，G0期細胞分為兩種。其中已分化細胞將永遠退出細胞周期而死亡，而其他再次進入細胞周期的細胞則為干細胞，后者隨后轉變為扁平細胞、立方細胞，并分化出基底細胞、粘液細胞、纖毛細胞。實驗結果[15-17]提示，氣管干細胞存在于氣管抗5-FU G0期細胞中。此后又證明上述細胞Hoechst33342熒光染色陰性，ABCG2陽性。在5-Fu誘發人支氣管損傷修復的過程中，周瑩等[18]證明氣管干細胞存在于對5-Fu有抗性的氣管G0期細胞中。同時，采用流式細胞儀方法可富集羅丹明（與Hoechst33342相似）陰性細胞。王琳琳等[19]觀察了大鼠氣管損傷修復過程中ABCG2的動態表達，證明在正常氣管上皮中ABCG2為陰性。經5-Fu打擊后，ABCG2出現，且在培養6 h-12 h達到高峰，此后隨著干細胞的分化而下降。廖愛軍等[20]經大鼠體內氣管損傷修復過程中，氣管干細胞定位所得的結果與之相同。

3 細支氣管及肺干細胞的幾種觀點

遠端支氣管不存在基底細胞，Clara細胞來源于經萘損傷后少量存活的耐受或“變異”Clara細胞（Clarav）的增殖與自我更新。在支氣管/細支氣管交界處存在著緊鄰神經上皮小體（NEBs）[21]且保留標記的Clara細胞亞群。后者與細支氣管/肺交界處均可表達sftpc和scgb1a1[22]，能夠在萘損傷后進行增殖修復。由于變異Clara細胞不表達Cyp2f2酶（一種可將萘轉化為毒性產物的P450細胞色素族），故可耐受萘損傷。這種表達缺陷反映出其相對于多數Clara細胞而言，為分化較低的細胞。變異Clara細胞與更加“經典”的未分化干細胞相比較，僅僅是其所表達的分化細胞標記物不同［降鈣素基因相關肽、Clarav細胞分泌的scgb1a1，以及細支氣管肺泡干細胞（BASCs）分泌的sftpc和scgb1a1］。

Giangreco等[23]利用萘處理小鼠終末細支氣管6 h剝離Clara細胞后，經皮下微泵給予［3H］7天。實驗者將細胞核內含5個以上銀粒的細胞定義為“被標記”細胞，含15個以上銀粒的細胞定義為LRCs。45天后，LRCs占全部標記細胞的12%。該實驗將終末細支氣管干細胞定位于支氣管腺泡導管連接處（BADJ）[22]。以往的研究中，BASCs的分離及分型多遵照其Sca-1+CD45-CD31-CD34+的免疫表型[24]。而近期的研究將流式細胞分析與小鼠模型相結合，Hayashi等[25]認為上述標記物并不能真正從Clara細胞群中分離出干細胞。新的細胞表型的標記物需要通過細胞顯微切割和微陣列分析等多項技術進行證實。經萘損傷后的纖毛細胞能否跨組織類型分化、變異Clara細胞與BASCs是否為穩態或受損組織中唯一具備干細胞潛能的細胞類型，尚無定論。有些模型能以其各自方式摧毀纖毛細胞或I型肺泡細胞。摧毀方式包括吸入二氧化氮和臭氧（選擇性殺傷纖毛細胞）等氧化劑或服用博萊霉素（殺滅I型細胞）等化療劑。上述研究結果皆支持纖毛細胞可由Clara細胞再生而來，而I型細胞可由II型細胞所產生。但這些研究結果還需要通過體內譜系學加以證實[26-28]。而是否所有的II型細胞都能生成I型細胞，或是僅在如BASCs等特定區域才有此能力，目前尚無定論。

4 氣管及肺干細胞的分子調節

這些研究主要集中在基因操控信號通路、肺發育和肺癌發生過程所涉及的分子機制。通過經典的Wnt信號通路，包括β-catenin[29-31]或者通過MAP激酶或Ras通路，PTEN[32]、GATA-6[33]和Bmi1[34]的信號途徑。這些研究通過基因敲除或使用目的基因干預方法導致靶基因的表達發生改變。通過對β-Catenin信號通路的激活，K-Ras[35]信號途徑或GATA-6[36]、PTEN、PI3激酶或者是p38αMAP激酶[37]的丟失，已經發現導致CCSP/Pro-SPC雙免疫陽性細胞的增加和富集，有些學者認為這些就是支氣管干細胞。將胚胎干細胞特異基因Oct3/4.Sox2.Nanog導入纖維母細胞或皮膚細胞后產生干細胞樣細胞，表明其具有維持未分化狀態的能力[38-43]。Song等[12]最新研究發現，常態氣管粘膜上皮不表達Oct3/4.Nanog.Sox2，而經5-Fu處理后，氣管粘膜上皮基底膜僅殘留G0期細胞，卻出現Oct3/4.Nanog.Sox2表達。認為這些陽性表達的細胞是通過核再編程，從而轉變為干細胞。細胞空白區域填補后，伴隨分化，這些陽性表達細胞逐漸減少；恢復假復層纖毛柱狀上皮后，上皮細胞恢復Oct3/4.Nanog.Sox2陰性。初步研究結果表明，在受到嚴重打擊后，殘存的G0期細胞Oct3/4.Nanog.Sox2基因啟動子發生DNA去甲基化，核再編程，表達Oct3/4.Nanog.Sox2基因，而其本身轉化為干細胞，隨后Oct3/4.Nanog.Sox2啟動子甲基化，基因沉默，干細胞開始分化，亦即表觀遺傳學調控干細胞分化。