線栓法大鼠腦缺血再灌注模型改良與評價

吳遠華 朱廣旗 胡 蓉 仲秀艷 蘇紅梅 歐陽泠星 吳幫啟 舒遵華 王 強

1)貴陽中醫學院第一附屬醫院神經內科 貴陽 550002 2)山東臨沂市人民醫院中醫科 臨沂 276000 3)廣東清遠市人民醫院中醫科 清遠 511500 4)天津中醫藥大學第一附屬醫院針灸科 天津 300193 5)長春中醫藥大學附屬醫院 長春 130021 6)湖北襄樊市中醫院 襄樊 441000

本研究在實驗過程中發現一改良線栓法制作MACO大鼠模型,成功率高,且無需借助顯微鏡即可進行操作,現將該方法介紹如下。

1 材料和方法

1.1實驗動物60只健康,清潔級SD大鼠,雌雄各半,鼠齡3～4個月,體質量260～300 g,由貴陽醫學院實驗動物中心提供,飼以標準育成飼料,自由飲水。

1.2模型的制備見圖1、2。

1.2.1 線栓頭的制作:線栓頭制作選擇直徑0.26 mm(3-0)市售尼龍魚線,長4.0 cm,頭端去棱角使之鈍化,并距頭端18、20 mm處分別作一標記,酒精清潔后置生理鹽水中備用。

1.2.2 模型的制作:大鼠大腦中動脈梗死(MCAO)模型參照Zea Longa等報道的方法加以改進,即選用頸外動脈插入線栓法。具體方法如下:(1)大鼠以3%水合氯醛(1 mL/100 g體質量)腹腔注射麻醉。(2)頸前皮膚正中切口,暴露左側頸三角。(3)分離左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)。(4)用雙極電凝器電凝ECA分支翼腭動脈(PPA),結扎、切斷、游離ECA主干,在其根部用 1號線打一松結。(5)用縫合線暫時阻斷CCA和ICA血流,在ECA殘端剪一約相當于ECA直徑2/3大小的切口,將制備好的栓線插入ICA(預先蘸有肝素鈉),至阻斷ICA血流處。(6)不完全結扎ECA根部絲線,去除暫時阻斷ICA血流的縫合線,線栓從頸外動脈插入,進入頸內動脈顱內段,當遇有輕微阻力時停止,結扎ECA根部絲線,去除暫時阻斷CCA血流的縫合線。(7)栓子插入19～22 mm,栓線經 ICA分叉輕插入顱內至大腦前動脈(ACA),該深度恰好堵塞MCA開口。(8)消毒、縫合皮膚。對照組:大鼠大腦中動脈梗死模型參照Zea Longa等報道的方法進行。

1.2.3 動物模型制作成功的標準:參照Zea Longa評定進行神經功能缺損程度的評價:0級,無缺陷;1級,不能伸展對側前肢;2級,對側前肢屈曲;3級,輕度向對側轉圈;4級,嚴重的轉圈;5級,對側癱瘓。3～4級為模型制作成功。

1.2.4 腦梗死體積的測定、評價模型穩定性:大鼠48 h存活率再灌 48 h,取腦,測量大腦長,切片,厚 2 mm,TTC染色;4%多聚甲醛固定24 h;照相,圖像分析系統計算腦梗死體積,采用梗死率表示梗死體積(梗死率:梗死面積/總面積×100%=(S1+S2+S3+….SN)H/(S1總+S2+SN總)H,S表示每片的梗死體積,H表示每片厚度)。計算實驗組與對照組大鼠腦梗死體積的變異系數(變異系數的計算公式:CV=s/ˉx×100%,s表示標準差,ˉx表示平均數,CV表示變異系數),比較2組大鼠腦梗死體積的穩定性。觀察大鼠48 h存活率。

1.3統計學方法采用均數±標準差(s)表示,組間比較用獨立t檢驗,計數資料使用χ2檢驗。腦梗死體積的穩定性用變異系數(coefficient of variation)表示。

2 結果

2.1模型成功率2組大鼠共60只,5只死于麻醉意外,實驗組2只,對照組3只,被排除。實驗組成功制作模型20只,失敗6只,死亡2只,成功率71.43%。對照組成功21只,失敗4只,死亡 2只,成功率 77.78%。2組大鼠模型成功率之間差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2神經功能缺失評分實驗組模型中,10只大鼠神經功能評分達3級,3只 4級,3只 5級,4只在3級以下,神經功能評分在3～4級的大鼠所占比例為65.00%;對照組中,14只大鼠神經功能評分達3級,2只達4級,2只5級,3只在3級以下,神經功能評分在3～4級的大鼠所占比例為76.19%,2組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.3腦梗死體積實驗組腦梗死體積為(32.42±7.62)%,對照組為(35.52±5.79)%,上述各指標與傳統的 Zea Longa線栓法模型相比差異無統計學意義(P＞0.05)。2組的模型穩定性相近,實驗組腦梗死體積變異系數為23.50%,對照組變異系數為16.30%,2組腦梗死體積之間差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.4 48 h存活率實驗組神經功能評分達4級的大鼠死亡7只,評分達3級的大鼠死亡1只,病死率40%;對照組大鼠中神經功能評分達4級的大鼠死亡9只,評分達3級的大鼠死亡2只,病死率52.38%。2組大鼠 48 h,存活率間差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

在臨床腦血管病分類中,缺血性腦血管病占70%,而MCAO又占其中60%左右,因此對MCAO的研究在腦血管病研究中占有非常重要的地位。大鼠具有成本低、種系內純合性好、腦血管解剖特性與人類相似等特點,因此到目前為止,大鼠仍為腦缺血研究最常用的實驗動物。此外,大鼠尚具有較強抗感染能力和生命力,常規操作一般不會引起傷口繼發性感染,且動物存活時間相對較長,這些特性也給研究帶來了很大方便。近年來,國內外對大鼠MCAO模型進行了大量研究,除線栓法外,近年常用的有:(1)頸內動脈注射栓塞劑閉塞MCA法,此方法制作的栓子具有很大的隨機性,往往不能準確地閉塞MCA。(2)經顳下或經眶入顱電凝或結扎MCA法,該法由于需要開顱,必然引起腦脊液外流,損傷腦組織,影響了缺血后腦水腫和顱內壓病理變化的自然過程。(3)光化學誘導MCA血栓形成法,此法易引起微血管內皮損害及早期血腦屏障破壞,造成終末動脈閉塞,不同于大血管阻塞的自然病理過程。上述方法還有一個共同的缺點,即此類模型不能再灌流,不適合用于模擬人類腦梗死或溶栓藥物治療后血管再通方面的研究。

MCA線栓法是目前國內外廣泛應用的一種方法,1986年Koizumi[1]首次采用不開顱經CCA栓入尼龍線致大腦中動脈閉塞獲得成功,后經Zea Longa[2]對此法適當改進,而廣泛用于實驗性腦缺血研究。1993年 Garcia[3]和 Holland等[4]都采用Longa法制作 MCAO模型,結果認為 Longa法是成功的模型制作方法。另外,大量文獻報道[5-7],在前人線栓法基礎上進行部分改進,結果表明改進后的線栓法復制的可逆性局灶性腦缺血模型縮短了手術時間,簡化了模型制作過程,提高了模型成功率。該方法被普遍地認為是局灶性腦缺血標準動物模型,具有不開顱、效果肯定且可以準確控制缺血及再灌注時間等優點,因此用其研究神經元對缺血的敏感性、耐受性以及再灌注損傷和治療時間窗較為理想。同時該模型對動物本身的生理功能影響較小,動物存活時間長,也適用于慢性腦損傷的研究。值得注意的是,該模型實際上是機械性人工栓塞性卒中,與人群常見卒中發病過程存在差異,而且手術操作過程較為復雜,許多細節,如動物品系、體質量、栓子粗細以及插入深度是否得當等均會影響實驗結果。因此,在實驗過程中,綜合以上線栓法制備大鼠M CAO模型,采用以下方法:(1)采用了SD大鼠,該大鼠MCAO模型產生的梗死灶恒定,變異較小[8],將大鼠的體質量控制在(280±20)g,體質量過大,顱內血管增粗,栓線難以完全阻斷MCA血流;體質量過小,栓線則難以插入顱內;選用栓線的直徑為0.26 mm,插入栓線的深度為19～22 mm。(2)大鼠以3%水合氯醛(1 mL/100 g體質量)腹腔注射麻醉,麻醉效果不好時,可少量追加,盡量減少不必要的麻醉死亡。(3)保持室溫在25～30℃,在分離動脈過程中,注意保護沿著ECA、CCA走行的迷走神經,防止呼吸道分泌物過多。呼吸道分泌物過多時可適當吸痰,術后注意保溫,這些措施可以提高動物的生存率。(4)另外還發現,Zea Longa等在大鼠清醒狀態下將留在體外的尼龍線拔出以再通血流,大鼠清醒時,受拔線的刺激會用勁掙扎,引起蛛網膜下腔出血,大鼠病死率高,于是在給大鼠拔線再灌注時再次麻醉大鼠,降低了顱內出血率,使實驗成功率大大提高。(5)不結扎翼腭動脈(PPA),提高再灌注成功率。有實驗表明[9],結扎PPA,ICA內的栓線周圍易形成血栓,致血管閉塞,再灌注時,難以保證正常的血供,且PPA不是基底節區側支循環的主要供應血管,結扎與否,并不影響腦梗死體積和神經缺失癥狀。(6)栓線制作方法直接關系到模型成功與否及蛛網膜下腔出血發生率,栓線制作方法的改進主要是對栓線頭端的處理。本實驗采用頭端去棱角鈍化的方法制作栓線是模型改進的最重要步驟。目前使用的栓線頭端的制作方法主要有以下幾種:Koizumi[1]的方法是在栓線頭端涂以硅樹脂,但 Memezawa[10]認為該方法較難;Longa是把栓線的頭端燒成球形;Belayev[11]的方法是先用火加熱使栓線頭端變鈍,然后在頭端涂以多聚賴氨酸溶液。Laing曾將Longa法和Koizumi法進行對比研究,發現Longa的方法成功率較低,且蛛網膜下腔出血發生率較高。以上方法制成的線栓頭端直徑大小不容易控制,導致線栓粗細不均,影響模型的效果。本實驗使用頭端去棱角鈍化的方法制作栓線進行造模,較容易使線栓頭端直徑統一,實際操作發現SAH發生率低,因此本實驗采用該種線栓處理方法造模。實驗研究表明,改良后的大鼠MCAO模型在制作成功率為71.43%;神經功能缺失評分3～4級為 65.00%;實驗組腦梗死體積為(32.42±7.62)%。上述各指標與傳統的Zea Longa線栓法模型相比差異無統計學意義(P＞0.05)。2組的模型穩定性相近,實驗組腦梗死體積變異系數為23.50%,對照組為16.30%,2組腦梗死體積之間差異無統計學意義(P＞0.05)。提示改良的大鼠MACO模型是一種穩定性好、可重復率高的大鼠腦缺血/再灌注模型。

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