毛囊干細胞雙向分化的分子調控機制

鄧立歡 楊斌

隨著皮膚組織工程研究的逐步深入，毛囊干細胞有望作為穩定的種子細胞用于組織工程化皮膚的構建，并應用于臨床。目前的研究表明，皮膚表皮細胞和毛囊各種細胞成份都來源于位于真皮層的毛囊外根鞘隆突區的毛囊干細胞，即毛囊干細胞具有雙向分化的潛能，其分化方向有可能是受細胞增殖分化的內源性生物信號通路和外源性微環境調節控制的[1-6]。本文就近年來毛囊干細胞特性、定向分化生長的調控機制研究進展做一綜述。

1 毛囊干細胞的定義及其特性

研究發現，表皮下的毛囊外根鞘的突隆區（Outer root sheath，ORS）存在著周期性增殖和分化的干細胞。Cotsarelis等[1]通過3H-TDR給新生和成年Senear小鼠皮下注射，發現大部分慢周期、標記儲留細胞（Label-retaining cells，LRCs）位于毛囊隆突區，提出了毛囊突隆區是干細胞存儲區的假設，稱這類細胞為毛囊干細胞（Hair follicular stem cells，HFSC）。Kobayashi等[2]及Rocha等[3]采用顯微解剖方法，分別分離鼠和人的毛囊進行細胞培養，其結果均支持了這一發現。Oshirm等[4]通過轉基因小鼠的毛囊嵌合體的研究，證實每個毛發周期性生長的干細胞為HFSC。HFSC和表皮干細胞（ESC）同樣具有極強的修復和再生能力。HFSC是ESC的先祖細胞，較后者具有更強的多向分化、增殖能力。

HFSC在一定條件下可分化增殖為皮膚附屬腺體、毛囊等組織的細胞。Hoffman等[5]發現，在毛囊外根鞘的隆突區存在GFP陽性細胞，在體外可以分化成神經細胞、角化細胞、平滑肌細胞及黑素細胞等。

Taylor等[6]HFSC的研究表明，HFSC是一種多能干細胞（Pluripotent stem cells），具有向毛囊及表皮細胞雙向分化的潛能，在正常生理條件下可維持表皮細胞的自我更新。毛囊干細胞的強大增殖能力與其定向分化作用是分不開的。毛囊干細胞并不直接分化為終末分化細胞。Soosan等[7]發現，表皮ESC通過不對稱分裂，分化為一種有限分裂循環的細胞，稱為短暫擴充細胞（Transient amplifying cells，TAC）。再分化為終末表皮細胞。因此，HFSC具有分化成所有表皮細胞的特性，不只是作為毛發正常生長周期中的存儲細胞，在一定條件下可分化增殖為附屬腺體，并參與皮膚損傷的再生修復。

2 毛囊干細胞的定位

位于毛囊隆突部的HFSC等同于LRCs。隆突部的細胞分子標記，如CD34表達及K15活性增加等，可使人們從小鼠毛囊中定位和區分該細胞。隆突部細胞具有干細胞的典型特性，包括多向分化、強大增殖潛能和靜息狀態等。細胞系分析（克隆分析）表明，成體毛囊所有表皮及毛發源自隆突部細胞。

Michel等[8]用角蛋白 19（K19）及 3H-TDR雙標記表皮細胞，證實K19陽性的細胞均為LRCs，并發現在有毛表皮中，K19陽性細胞僅出現在毛囊隆突部。Taylor等[6]使用BrdU和HTDR為標記物行雙標記法，標記追蹤HFSC，發現HFSC可雙向分化，不僅形成毛囊，而且提供一系列增殖性角化細胞進入表皮，形成表皮細胞。

3 毛囊干細胞增殖和分化生長的分子調控機制

雖然HFSC具有多項分化能力，但其增殖分化是受到調控的。表皮組織自身更新及細胞平衡是通過源自干細胞的穩態，即表皮穩態的維持是組織中新生細胞形成及衰老細胞丟失之間的平衡。不同位置的皮膚干細胞在固有機制和表皮形態發生信號通路調控下，重復不斷地維持表皮穩態。

Oshima等[4]對成年小鼠胡須毛囊外根部包含的多能干細胞研究發現，這些干細胞在相關信號下增殖為頭發毛囊、附屬腺體及表皮等。對表皮生長觀察發現，表皮和皮脂腺的生長呈連續性，皮膚基底層細胞增殖并向外遷移并在表皮停止生長、生成鱗屑及脫落，此過程與角化細胞變化相關。表明該區域存在調控多能干細胞向胡須生長的控制干細胞的交通。Soosan等[7]也指出，皮膚上皮的多能干細胞在無嚴重創傷狀態下，受到嚴格的控制。

許多因素對毛囊干細胞的增殖分化過程起調控作用，包括細胞間、胞外基質以及各種細胞因子間的相互作用均可影響干細胞的增殖分化。影響毛囊干細胞增殖分化的因素分為外源性和內源性兩大類。

外源性調控因素系毛囊干細胞的微環境“壁龕（Niche）”，包括：①細胞分泌的多種細胞因子；②膜介導的胞間作用；③整合素及胞外基質。

內源性調控因素包括：①作用于細胞不對稱分裂的各種蛋白質；②調控基因表達的轉錄調控因子；③胞內遺傳物質（染色體）的修飾；④在細胞周期中設置的，控制短暫性擴增分裂的“鐘”。

3.1 外源性調控因素——微環境“壁龕（Niche）”

干細胞在生命過程中為血液、骨組織、皮膚，神經系統、肌組織及其他組織提供充足新細胞。正常情況下，干細胞處于靜息狀態，在特殊的生命周期中可被激活，特別是損傷修復時。而所謂的“壁龕”就是內部組織微環境控制的各類有效因子，包括鄰近的各種細胞、細胞因子、整合素、膜蛋白介導的胞間作用以及胞外基質等。干細胞的分化受其所處的微環境的影響是毋庸置疑的。

Sean等[9]對毛發周期的觀察中發現，對于小鼠毛囊干細胞的Niches，位于Bulge區域的干細胞會促進根部毛發及真皮乳頭新生細胞的增殖，最終促進毛發的增生。隆突部細胞同樣可以重建皮脂腺。壁龕中的干細胞可移行出隆突，參與皮膚創傷修復。然而在隆突區單個干細胞鑒別以及壁龕的特性仍未有定論。

Toshio等[10]對Wnt信號通路進行封閉時發現，壁龕中的HFSC計數增加，同時降低了被照射小鼠造血系統的造血能力，說明了Wnt/β-catenin活力對骨髓微環境中HFSC靜息狀態的維持至關重要。此外，對于HFSC而言，細胞外基質成分改變也影響干細胞的分化，其主要通過阻礙和/或調控毛囊干細胞微環境中的細胞因子的濃度來實現。

3.1.1 分泌性細胞因子

TGF-β家族是目前研究較多且對毛囊發育較重要的分泌性細胞因子之一，對調控毛囊的形態學發生和周期性循環具有重要的作用。TGF-β超家族由大量結構相關的多肽生長因子組成，包括 TGF-β、激活素（Activin）/抑制素（Inhibin）家族、骨形成蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）和米勒抑制物（Mullerian-inhibiting substance）家族等幾大類[11]。 TGF-β信號轉導通路包括Smad蛋白信號轉導途徑/Ras-絲裂原激活蛋白激酶 （Ras-Mitogen-Activated Protein Kinase，Ras-MAPK）途徑和非Smad依賴性途徑。研究發現，TGF-β可能通過促進毛囊細胞凋亡和抑制毛囊細胞增殖調節毛囊的形態學發生發育和生后毛囊的周期性循環，參與雄激素性脫發的發生和發展，介導其他因素和因子對毛囊生長發育的影響。

3.1.2 膜整合蛋白介導的胞間作用

有些細胞的調控信息是通過細胞-細胞的直接突觸作用來進行傳導的。跨膜蛋白Notch及其配體Delta或Serrate對干細胞分化具有重要作用。當Notch與其配體結合時，干細胞進行非分化性增殖；Notch通路被抑制時，干細胞進入分化程序，分化成各種功能細胞。而對于隆突部的干細胞來說，Notch的作用是使干細胞向過渡性擴充細胞（TAC）分化[12]。

3.1.3 整合素（Integrin）

從本質上來說，HSFC是ESC的前體細胞，黏附特性也是其特征之一，對Ⅳ型膠原、層粘連蛋白及胞外基質有較強的黏附作用。多數過渡性擴充細胞（TAC）的黏附約需20～60min。整合素家族是介導其與胞外基質黏附的主要分子，特別是α6和β1整合素為干細胞的增殖提供了良好的微環境[13]。Kim等[14]在電子顯微鏡下發現快速黏附細胞體積較小而核漿比率大，利用干細胞制成的皮膚替代物的基底層表達α6和β1整合素。此外，胞外基質對β1整合素表達的調節和基底膜中細胞外機制成分的局部差異，都會影響到干細胞的分布和分化方向。

3.2 內源性調控因素

3.2.1 Wnt家族及β-catenin

Wnt基因編碼的脂類、分泌性信號分子構成了一個大族，哺乳動物的基因組編碼19種Wnt蛋白及10余種卷曲7次的跨膜受體，組合傳導不同信號。按照Wnt的生物行為，可將其分為兩大類：一類是過量表達的Wnts，如Wnt-1、Wnt-3α和Wnt-8等，可誘導C57MG小鼠乳房上皮細胞形態改變；另一類如Wnt4、Wnt5a、和Wnt11等卻沒有上述功能[15]。

Wnt/β-catenin信號調控生長發育和疾病多個方面。βcatenin蛋白是Wnt信號途徑中的必需分子，在控制毛囊形成中是不可或缺的。β-catenin基因位于染色體3p 21-22，由CTNN b1基因編碼，長約40992 bp，表達產物為92 kD的蛋白，具有高度保守性，含有3個重要的功能性區域：含150個氨基酸的N-末端、550個氨基酸的中間連接臂重復區和100個氨基酸的C-末端。其中，N-末端是β-catenin受GSK-3β磷酸化降解作用部位；連接臂重復區是β-catenin與多種配體，包括 Tcf/Lef、結腸腺瘤息肉病基因（APC）、Axin、E-鈣粘連素等結合的重要部位；而C-末端酸性較強，參與β-catenin與轉錄活化因子Tcf/Lef的結合[16]。

目前已知的Wnt蛋白家族成員中，能激活經典通路的有Wnt-1、Wnt-3α和 Wnt-8；非經典通路的包括 Wnt-5a及Wnt-11。在無Wnt信號的情況下，細胞質中的β-catenin和許多蛋白，如 AXIN、酪蛋白激酶 1（casein kinase 1，CK1）、大腸腺瘤息肉蛋白（APC）、糖原合成激酶（GSK-3β），一起形成多蛋白復合物。GSK-3β對β-catenin的第41、37和33位殘基進行磷酸化后，CK對β-catenin的第45位殘基進行絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，啟動泛素的共價修飾，β-catenin被蛋白酶體降解。

當Wnt蛋白表達增加時，這些Wnt分子與跨膜受體Frizzelds以及共同受體低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP-5、LRP-6）結合，進而通過散亂蛋白（Dishevelled，Dsh）的拮抗作用抑制β-catenin-AXIN-APC-GSK3β復合物的形成，降低GSK3β的活性，從而抑制β-catenin的磷酸化，使β-catenin在細胞內集聚，最后游離β-catenin進入細胞核內與Tcf/Lef結合，激活靶基因（C-myc、cyclin D1、CD44 等）的轉錄。 其中，C-myc和 cyclin D1等是Wnt/β-catenin-Lef/Tcf途徑的下游靶基因，它們的激活與細胞增殖、發育及腫瘤關系密切。βcatenin是整個信號途徑中重要的中心環節[17-18]。

毛發的生長周期主要包括3個時期，即生長期、退行期和靜止期。Wnt信號通路對胚胎發育和組織器官形態發生起關鍵作用，特別是在毛囊發生及分化過程中。而β-catenin的穩定性在經典的Wnt信號通路中是必需的。若缺乏βcatenin，干細胞就不能分化為毛囊角化細胞，而代之以向表皮細胞方向分化。轉基因鼠皮膚中持續穩定表達的β-catenin可使靜止期的毛囊向生長期毛囊轉變并過度生長；而短暫的β-catenin激活也會產生正常的毛囊生長。說明Wnt信號能維持毛乳頭處于毛發生長初期的狀態，保持其誘導毛發生長并誘導毛囊由靜止期向生長期轉變的特性。

Waikel等[19]發現，β-catenin-Lef/Tcf信號通路及其下游靶點基因C-myc在皮膚干細胞分化過程中具有重要作用，C-myc表達下調可引起β1整合素表達減少，從而影響干細胞的遷移和分化。DasGupta等[20]的研究表明，在Wnt信號途徑激活的形態發生過程中，表皮細胞內的β-catenin表達持續穩定，會激發毛囊形態的發生；而在毛囊隆突部干細胞群的β-catenin表達沉默，則β-catenin-Lef/Tcf介導的信號途徑活動喪失，最終引發毛囊干細胞向表皮細胞分化轉歸。位于隆突區的毛囊干細胞受調節后會向兩個方向發展：向上遷移和向下遷移的隆突上皮細胞沿著各自不同的途徑保持著毛發的生長和表皮的更新。當向下生長的毛囊干細胞推移遠離隆突后快速分裂的母質TA細胞，隆突部的干細胞又會進入常態的慢性周期循環中。經過一段持續增長后，TA細胞逐漸失去增殖能力，轉變為終末細胞，約2/3的毛囊會發生這種衍變。隆突部毛囊干細胞的后裔不僅能促進頭發生長，也能促使表皮和皮脂腺的增加，當毛囊上部隆突處的子代細胞移行到表皮層后會不斷增殖，為表皮細胞的不斷更新提供了保障。

3.2.2 Tcf 3/Lef 1家族

淋巴細胞生長因子（Lymphoid enhancer factor，Lef）/T 細胞因子（T-cell factor，Tcf）是胞核內的轉錄因子家族。Tcf 3/Lef 1是Wnt信號通路下游的轉錄因子，激活特異性基因的轉錄，可啟動下游的C-myc、cyclin D1等基因的轉錄與表達，調節細胞的生長。在皮膚中，Tcf 3通常作為轉錄的阻遏物，誘導相關基因負調控。實驗證實，通過轉基因技術能使Tcf 3陽性毛囊細胞穩定表達β-Catenin，結果使毛發周期過早激活。故Tcf 3的表達可能引起表皮細胞周期調控基因被抑制。而Lef1在毛囊基質細胞中表達豐富，在Wnt信號傳導通路中的β-Catenin的作用下，充當轉錄激活物，促進毛囊的分化。

Hoang等[21]證實，Tcf 3的激活，可誘導基因處于未分化、Wnt受抑制狀態。而且，被抑制的基因也抑制了參與調控分化的基因和轉錄因子（包括表皮、皮脂腺及毛囊分化的轉錄調節因子），使這3個終末分化通路被抑制。在缺乏Wnt信號下，Tcf 3會使皮膚表皮細胞維持在未分化狀態。而通過Wnt信號的調控，可使這些細胞向毛發方向分化。這些研究表明，Tcf 3可能抑制隆突區的細胞增殖及Wnt信號對干細胞活性的激活。

在毛發生長周期的增長階段，Tcf 3不僅在隆突區干細胞的靜止期中表達，同時在新形成的外根鞘（ORS）的外基底層表達。這些細胞被認為是游離干細胞向毛囊基底轉化的代表。Tcf 3在轉基因鼠表皮的表達使外根鞘/隆突形態形成，說明Tcf 3指定了某些特征（性狀）。在DNTcf 3表達而β-catenin缺失的相互作用域可有同樣表型，說明在決定這些特性中Tcf 3的作用可能并不依賴于Wnt信號。

Zhu等[22]利用逆轉錄病毒轉染角朊細胞，使細胞表達不同的β-catenin突變體，結果發現，氨基端截短的β-catenin突變體（因沒有GSK3β結合位點而不被降解）可增加培養細胞中干細胞克隆的比例。當β-catenin表達升高，隆突部細胞向毛囊基質細胞分化時，Tcf 3丟失，而Lef 1卻表達，可能與接受了Wnt信號傳導有關。當轉基因小鼠表皮基底層表達截斷的Lef 1時，其無法與β-catenin結合，毛發形成被終止，成體表皮基底細胞向多能胚胎樣外胚層轉變。這說明Lef 1的表達使干細胞向毛發方向發展，促進毛囊的分化。

Fathke等[23]采用小鼠背部全厚皮膚缺損的模型，檢測在創傷修復過程中不同時間段的Wnt蛋白表達情況，并用βgal報告β-catenin的表達，發現無機物氯化鋰（LiCl）可抑制GSK-3β的活性，激活β-catenin/TEF信號通路，結果部分樣本觀察到皮膚附屬器的形成，包括簡單的毛囊及皮脂腺結構。進一步說明了Lef在Wnt信號傳導通路中的β-Catenin作用下，充當轉錄激活物，促進毛囊的分化形成。

隨著毛囊干細胞作為皮膚組織工程種子細胞研究的不斷深入，人們對干細胞的增殖、分化調控機制的探索愈加重視。干細胞微環境外源性調控、內源性調控以及各類信號傳導通路作用于毛囊干細胞等問題的研究，可為解決臨床難題提供相關的理論基礎。Wnt信號通路，特別是Wnt/β-catenin-Lef/Tcf路徑，是毛囊干細胞重要的生長調控信號，Wnt信號途徑中各種生物大分子、受體、配體和無機分子等以及各信號通路之間，相互作用而產生生物學效應，猶如瀑布級聯反應。但尚有很多調控機制仍不明確，需要更深入地研究探索。

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