微孔陣列技術在干細胞研究中的應用

何懿 欒杰

微孔陣列技術在干細胞研究中的應用

何懿 欒杰

1 背景

傳統的細胞體外培養，是將大量的細胞集中接種于相對“較大”（毫米至厘米級別）的培養空間平面模板上，如果希望通過這種方式描述某種細胞的行為，則只能將整體細胞行為平均化來描述單個細胞行為。然而，并非所有細胞群體行為都是一致的，并且有時孤立細胞的行為對于某些研究是至關重要的。例如，在干細胞研究中，由于很難單純依靠細胞表型將干細胞與部分分化的祖細胞分離，大多數情況下成體干細胞的生長速度顯著慢于祖細胞，故將單個細胞行為作為是大量細胞行為平均化的表現就會產生很大誤差。利用現有的多孔細胞培養板（如96孔板）進行單細胞研究時，不僅需要消耗大量昂貴的細胞培養液，且由于其無法約束單個細胞在培養孔內的活動，利用顯微鏡追蹤細胞行為也十分困難，最終大多導致細胞脫離顯微鏡視野無法追蹤。這種帶有一定盲目性的試驗方法，無法滿足對單個細胞行為研究的需要。另一方面，眾多復雜的研究系統（如微流體閥、光鉗、雙向電泳及聲波等）雖能夠對單個細胞進行捕捉、操控及研究，但卻過于精巧，或者不能與現有的實驗室技術設備兼容。

近年來，有學者開始嘗試使用微孔陣列（Microwellarrays）作為單個細胞研究的平臺，這是一種利用微尺度技術（Microscale technologies）在微米級水平進行加工、制備和分析的新技術[1]，可以在不同材料（玻璃、硅、PDMS、PLGA等）表面制作大量（每平方厘米內有數百至數千個）微孔，其形態、排列及密度可根據實驗內容而異。微孔陣列是一種相對簡單的實驗技術，它能夠與日常實驗研究設備兼容。將微孔陣列應用于生物研究領域，在控制培養過程細胞外微環境和小型化高通量實驗方面表現出前所未有的潛力，可望成為解決這一領域諸多難題的重要工具[2]。近幾年來，隨著無需使用昂貴的“潔凈室”以制造微尺度設備的軟印模技術和光刻技術的出現，微孔陣列在生物醫學和生物學領域的應用已越來越多[1]。

光刻（S oft lithography）技術，是在硅板襯底上覆蓋光刻膠，然后在光刻膠表面放置光遮膜，再將它們暴露于紫外光下，通過光遮膜的特定空隙透過的紫外光，可將光刻膠與硅襯底交聯[3]；隨后，利用有機溶劑將未交聯的光刻膠溶解洗脫，生成由大量微米級光刻膠形成的薄硅片組成的“模板”，然后在“模板”表面覆蓋彈性印模，經熱固化和剝離后可生成微孔模板，可直接用于細胞培養[4]。利用這種方法加工所得的微孔陣列，精度高，表面質量好，制作效率高，原材料的利用率接近100%[5]。

軟印模多采用聚硅氧烷（PDMS）來進行制備[6]，這是一種透明的、生物相容性良好的彈性材料，可直接應用于細胞培養支架的構建。雖然PDMS因其具有疏水性，且對培養介質內的蛋白成分（如生長因子等）有較強的吸附作用，限制了其在生物工程領域的應用，但它可以作為圖形轉移印模，將微孔陣列設計圖形轉移至生物親和力好的材料表面（如水凝膠），這樣制備的微孔陣列將具備更好的物理、化學性能[4]。

利用微孔陣列可以讓大量的單個細胞在數分鐘內依靠重力隨機沉降至微孔底部，并允許在細胞培養的數天內對其進行分析[7]。作為單細胞研究平臺，微孔陣列與傳統培養方法相比，并沒有明顯功能上的差異，但它的結構更為精巧，如果搭配低通量平臺（如96孔板），同樣可以進行高通量分析[4]。

但是，對于大多數微孔陣列而言，全部固定的細胞都處于共同的培養基內，就如同在同一個培養板內一樣。也就是說，單個克隆的細胞很有可能通過分泌旁分泌信號因子影響鄰近的細胞。除了這一不足，微孔陣列的制備和應用都非常簡便，已被廣泛地應用于細胞的體外培養[4]。

目前，微孔陣列技術主要應用于以下3個方面：①模擬三維環境，形成可調控的單細胞“準三維”微環境。②進行干細胞和腫瘤細胞的生物學研究，如藥物篩選等。③實時顯微鏡動態高通量分析。

本文擬對微孔陣列技術在干細胞、細胞分化及細胞外微環境等研究領域的應用進行綜述。

2 應用微孔陣列技術建立干細胞克隆培養與誘導系統

目前，干細胞研究中的主要問題之一，是對細胞外微環境中的各種因素對干細胞生長與分化的影響還不甚了解。微孔陣列技術可以用來控制培養條件，并進行高通量實驗，從而成為研究體外干細胞培養及細胞外微環境的有力工具。

誘導胚胎干細胞分化的理想的實驗系統，應能保證在大批量培養時，系統微環境基本保持穩定，不應產生過大的變化。同時，應當能夠進行原位分析，且仍能參與其他實驗過程。總之，實驗系統應當簡單、經濟，并能與現有實驗室設備通用。現有的體外細胞培養技術，很難高效率獲得形態均一度良好的干細胞群。傳統干細胞培養方法，是將擴增的干細胞克隆從培養平面刮下，會導致形態特別異常的克隆，細胞間尺寸和形狀差異很大[8]，這種異常也會隨著增殖分化傳到下一代。因此，同一克隆內部或不同克隆間的局部微環境差異很大。干細胞群具有多向分化潛能，且干細胞克隆尺寸對細胞自我更新和分化具有一定影響，利用微孔陣列培養干細胞，可以有效的提高所獲得干細胞群的均一度，并能夠提供一套高效提純干細胞的工藝流程。微孔陣列允許干細胞在克隆水平以高通量方式生長，也可以用于制備干細胞克隆，可以很好地控制其形狀和尺寸，這可能有助于克服目前干細胞體外培養中的一些問題。經優化后的微孔陣列系統有望成為胚胎干細胞分化研究及高通量干細胞實驗的良好工具，可以生成大量形態接近并易于采集的細胞集落群[9]。

因此，微孔技術已經被用來制備小鼠和人類胚胎干細胞的可調控細胞克隆。體外培養時，首先應用明膠涂層微孔基板將人類胚胎干細胞選擇性粘附于微孔底部，使干細胞克隆固定于局部增殖[10]，這些細胞克隆帶有可持續一段時間的多能性標記物；隨后，將滋養層細胞接種至微孔陣列中，并誘導其形成用于維持胚胎干細胞群未分化階段的單層細胞[11]。這種共培養體系既可使胚胎干細胞從滋養層細胞獲得自身增殖所必須的各種因子，同時又能夠對最終獲得的克隆尺寸進行調控。

此外，微孔陣列的材質對于所培養的細胞有較大影響，其中聚乙二醇（PEG）微孔陣列相對于傳統的懸浮培養技術，可以更好地控制干細胞群的體積、形態和均一度[12－13]。

3 利用微孔陣列分析單個成體干細胞的生長及轉歸

由于成體干細胞克隆非常稀少，且其形態、大小呈高度異質性，故微孔陣列非常適合作為其生物學行為的研究平臺。Bhatia等[7]在玻璃蓋玻片上制備直徑為20～500μm的微孔，密度為每片蓋玻片上10 000個微孔，將小鼠單個成體祖細胞置于微孔內進行動態分析。在培養的數天內，應用自動動態細胞顯微鏡追蹤數千個單個細胞的擴增與死亡情況。實驗表明，相同細胞群來源的克隆與少量具備高擴增能力的克隆相比，其擴增能力存在明顯差異。并且，微孔內起始細胞數量的多少（1個或數個細胞）并不會對增殖能力產生明顯的影響。

Cordey等[14]在另一項類似的研究中，應用聚二乙醇（PEG）水凝膠微孔陣列，研究小鼠單個神經干/祖細胞生長成多細胞團的過程。該實驗與傳統的采用非粘附性塑料培養皿培養相比，所獲得的神經細胞活性是傳統方法的兩倍。利用微孔陣列可有效地隔離單個細胞，從而使其各自增殖，并可觀察在不同大小的孔徑中生成的神經細胞球形態。相對于傳統神經細胞球培養，細胞經微孔培養生成神經細胞球，再培養1周后，干/祖細胞表型（羥乙基淀粉+嵌套蛋白+β3微管蛋白）表達率依然很高。

微孔陣列技術同樣可以應用于單個造血干細胞（HSC）的行為研究。Dykstra等[15]利用PDMS微孔陣列技術，追蹤小鼠單個造血干細胞的動態行為，并通過體外培養細胞擴增行為來印證細胞在體內所發揮的功能，如模擬經致死劑量照射后的小鼠血液系統的多向重建過程等。根據已有的對單個細胞分析，發現增殖中的造血干細胞的新特征，例如特殊的形態有望成為預測細胞增殖不同階段的標志。

Lutolf等[16]利用聚乙二醇（PEG）水凝膠材質的微孔陣列進行了進一步研究，他們根據熒光活性將不同系干/祖細胞克隆從小鼠骨髓內純化分離。實驗表明，與微孔內培養的祖細胞相比，單個干細胞細胞周期能夠明顯延長。應用自動延時顯微鏡連續觀察到單個細胞，可以對其增殖活性進行量化計算，可以將每個微孔內子代造血干細胞的生成數量繪制成時間相關函數。

Kurth等[17]研究了空間局限和粘附反應對CD133陽性的人造血干細胞體外培養生長的影響。他們在微孔表面被覆纖維連接蛋白涂層，研究單個細胞在其上的生物學行為。實驗表明，當單個造血干細胞處于較小的微孔中，其增殖和分化都會減低。在對貼附的細胞逐個分析后發現，在較小口徑微孔中的造血干細胞，DNA合成減低且造血干細胞表面標記水平增高。實驗表明，將人造血干細胞固定在纖維連接蛋白被覆的微孔空間內，可以維持細胞保持干細胞狀態。

綜上所述，在微孔內進行成體干細胞的動態研究，表明微孔陣列會對體外單個細胞培養造成影響。此外，微孔陣列技術可以用于多種其他干細胞克隆的研究，有助于揭示干細胞調節的機制，對于研究干細胞臨床應用中的調控意義重大。

4 利用細胞微陣列分析細胞克隆和調控細胞形態

大多數的體外培養系統中的細胞外微環境，與體內環境是不同的。體內環境中，細胞處于一個受調控的微環境中，受到與臨近細胞相互作用、可溶性因子和細胞外基質等各方面因素的嚴格調控。尤其是這些信號分子的時間、空間分布受到嚴格調控，且不同器官之間各不相同。另外，體內環境的細胞是處于三維立體環境中，干細胞的分化是基于一系列時間和空間調節信號，而非培養皿中的二維空間。

細胞外信號對成體干細胞和胚胎干細胞轉歸的判斷至關重要。將成體干細胞置于能獨立調控其自我更新和分化的陣列微孔中，給予適當的信號，則有可能使胚胎干細胞分化為特定的細胞類型的過程，變得更為高效且可重復[18-22]。微尺度技術既可以控制細胞-微環境的相互作用，同時可結合高通量技術以檢測細胞外微環境中的多種信號分子，為尋找細胞外基質中影響細胞生發的信號因子提供了可能。

利用微孔陣列將細胞固定至特定幾何形態的材料上，可以研究眾多影響因素對細胞形態的作用。由于細胞粘附于微孔中后，可根據粘附區域形態調整自己的外形。這種形態上的變化引起細胞骨架特征的變化，并且已被證明與細胞凋亡和增殖有關[23]。Teixeira等[24]將人間充質干細胞放置于不同面積的纖維連接蛋白表面時，在較大表面的細胞粘附并平鋪生長，而較小表面的細胞則生長為球形，其中平鋪生長的細胞分化為成骨細胞，而球形細胞則分化為脂肪細胞。進一步的研究表明，細胞形態影響了RhoA通道的活性，表明分化過程中的機械應力對于干細胞的分化方向至關重要。因此，可以利用微孔陣列技術調控細胞外微環境，以調整細胞分化方向。

5 展望

隨著光刻和軟印模技術的廣泛應用和發展，微孔陣列技術已經取得廣泛應用。微孔陣列技術通過控制形狀、孔徑結構等特征來制備微組織成型的模板，也可成為改良的生物反應器；還可通過對細胞外環境微尺度結構的控制，研究細胞生長過程中，空間和時間的影響，包括細胞間、細胞與細胞外基質和細胞與可溶性因子的相互作用等；微孔陣列技術能夠同時研究多種環境因素對細胞行為的影響，可用來優化培養條件和研究材料與細胞間的相互作用。

相對于現有的細胞培養平臺，微孔陣列技術可以為體外細胞培養提供一個更為精密、可控的空間環境。通過改變這些環境或構建仿真細胞外環境，達到觀察細胞行為、分化、轉歸、信號傳導以及進行細胞組裝、細胞調控等目的。這一技術使人類對細胞行為的研究以及對細胞的控制提高到一個新的水平。

[1]Andersson H,van den Berg A.Microfabrication andmicrofluidics for tissue engineering:state of the art and future opportunities[J]. Lab Chip,2004,4(2):98－103.

[2]Whitesides GM,Ostuni E,Takayama S,et al.Soft lithography in biology and biochemistry[J].Annu Rev Biomed Eng,2001,3:335-373.

[3]Weibel DB,DiLuzioWR,Whitesides GM.Microfabrication meets microbiology[J].Nat Rev Microbiol,2007,5(3):209–218.

[4]Mirren C,Marcus T,Ali K,et al.Integration column:microwell arrays formammalian cell culture[J].Integr Biol,2009,1(11-12): 625-634.

[5]沙菁契,侯麗雅,章維一.基于微立體光刻技術的組織支架的制備[J].華中科技大學學報(自然科學版),2007,35(21):61-63.

[6]Borenstein JT,TeraiH,King KR,et al.Microfabrication technology for vascularized tissue engineering[J].Biomed Microdevices,2002, 4(3):167-175.

[7]Chin VI,Taupin P,Sanga S,et al.Microfabricated platform for studying stem cell fates[J].BiotechnolBioeng,2004,88(3):399-415.

[8]Ungrin MD,Joshi C,Nica A,et al.Reproducible,ultra highthroughput formation ofmulticellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates[J]. PLoSOne,2008,3(2):e1565.

[9]Moeller HC,Mian M,Shrivastava S,etal.Amicrowell array system for stem cell culture[J].Biomaterials,2008,29(6):752-763.

[10]Mohr JC,de Pablo JJ,Palecek SP.3-Dmicrowell culture of human embryonic stem cells[J].Biomaterials,2006,27(36):6032-6042.

[11]Khademhosseini A,Ferreira L,Blumling J 3rd,et al.Co-culture of human embryonic stem cellswith murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates[J].Biomaterials,2006,27(36): 5968-5977.

[12]TanW,Desai TA.Microscalemultilayer cocultures for biomimetic blood vessels[J].JBiomed Mater Res A,2005,72(2):146-160.

[13]Torisawa YS,Chueh BH,Huh D,etal.Efficient formation ofuniformsized embryoid bodies using a compartmentalized microchannel device[J].Lab Chip,2007,7(6):770-776.

[14]Cordey M,Limacher M,Kobel S,et al.Enhancing the reliability and throughput of neurosphere culture on hydrogelmicrowell arrays [J].Stem Cells,2008,26(10):2586-2594.

[15]Dykstra B,Ramunas J,KentD,etal.High-resolution videomonitoring of hematopoietic stem cells cultured in single-cell arrays identifies new features of self-renewal[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006, 103(21):8185-8190.

[16]Lutolf M,Doyonnas R,Havenstrite K,et al.Perturbation of single hematopoietic stem cell fates in artificial niches[J].Integr Biol, 2009,1(1):59-69.

[17]Kurth I,Franke K,Pompe T,etal.Hematopoietic stem and progenitor cells in adhesivemicrocavities[J].Integr Biol,2009,1(5-6):427-434.

[18]Lin CC,Co CC,Ho CC.Micropatterning proteins and cells on polylactic acid and poly(lactide-co-glycolide)[J].Biomaterials, 2005,26(17):3655-3662.

[19]Kumar G,Wang YC,Co C,etal.Spatially controlled cell engineering on biomaterials using polyelectrolytes[J].Langmuir,2003,19(25): 10550-10556.

[20]Lee KB,Kim DJ,Lee ZW,et al.Pattern generation of biological ligands on a biodegradable poly(glycolic acid)film[J].Langmuir, 2004,20(7):2531-2535.

[21]Liu VA,Jastromb WE,Bhatia SN.Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers[J].JBiomed Mater Res,2002,60(1):126-134.

[22]Deutsch J,Motlagh D,Russell B,etal.Fabrication ofmicrotextured membranes for cardiacmyocyte attachment and orientation[J].J Biomed Mater Res,2000,53(3):267-275.

[23]Van Kooten TG,Whitesides JF,von Recum A.Influence of silicone (PDMS)surface texture on human skin fibroblast proliferation as determined by cell cycle analysis[J].JBiomed Mater Res,1998, 43(1):1-14.

[24]Teixeira AI,AbramsGA,Bertics PJ,etal.Epithelial contactguidance on well-defined micro-and nanostructured substrates[J].JCell Sci,2003,116(10):1881-1892.

book=298,ebook=24

Q813

B

1673－0364（2010）05－0298－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.05.018

2010年7月21日，

2010年9月15日)

100144北京市中國醫學科學院整形外科醫院整形八科。