成肌細胞的臨床應用進展

劉幸卉 廖 華

成肌細胞的臨床應用進展

劉幸卉 廖 華

成肌細胞是指胞漿中含有肌絲的肌組織前體細胞，來源于中胚層干細胞，胚胎發育過程中首先由間充質細胞分化為成肌細胞，然后分裂、融合成多核肌纖維，形成肌小管，再進一步分化為成熟的骨骼肌細胞。成肌細胞具有自我更新和促進肌纖維再生的能力。成熟個體心肌組織與平滑肌組織均不含成肌細胞；骨骼肌組織中的成肌細胞是以肌衛星細胞形式存在，位于肌纖維基底膜與肌膜之間，相互間不融合，也不合成收縮蛋白，因環繞多核肌纖維而得名[1]。生理狀態下，衛星細胞處于靜止狀態；在骨骼肌損傷及再生過程中，衛星細胞被激活，大量增殖、融合并分化，產生新生肌纖維。因此，成肌細胞在骨骼肌再生中是新生肌肉的細胞來源，起著關鍵作用。成肌細胞可以從肌組織中分離，可在體外條件下以克隆或混合培養、遺傳工程的方法大量增殖，并回輸至肌肉組織以治療肌肉的損傷或缺損[2]。

目前，成肌細胞的臨床應用已相當廣泛，本文就成肌細胞移植在心血管系統及肌肉損傷治療等方面的應用進展進行綜述。

1 成肌細胞是廣泛采用的基因治療靶細胞

在臨床和基礎研究中,利用成肌細胞的生物學特性作為基因治療的靶細胞有很多優點：①成肌細胞數量豐富，易獲取，可通過注射進行大規模細胞移植；②目的基因產物（有活性的蛋白）可在成肌細胞中高水平表達，并可分泌到細胞外；③成肌細胞可與宿主肌肉細胞融合，形成多核肌細胞，并可在肌纖維中長期存活，有利于目的蛋白穩定、持續地表達；④骨骼肌是藥物注射的常用組織，具有一定耐受性，肌肉組織血供豐富，表達產物易進入血液循環，到達靶器官發揮作用；⑤成肌細胞移植后不干擾鄰近組織的正常生理功能，不需膠原包埋，肌肉組織易于重復活檢，臨床應用簡便、安全[2]。Day等[3]以腺病毒為載體,將LacZ標志基因（B2半乳糖苷酶基因）轉入永生化成肌細胞，注入兔膝關節后檢測關節滑膜內目的基因的表達,6 d后在髕骨滑膜層見到大片表達目的基因的肌細胞以及有支架蛋白染色陽性的肌管和肌纖維，部分附著于髕韌帶、交叉韌帶止點及股骨髁間窩等處，7周后仍可見大量表達目的基因的細胞。Ye等[4]以聚乙烯亞胺納米顆粒為載體，把人血管內皮生長因子-165基因轉染自體骨骼肌成肌細胞，然后移植到急性心肌梗死大鼠心臟，4周后行分子學和組織學檢查，與單純注射DMEM和人骨骼肌成肌細胞組相比，轉染組大鼠心臟血管密度顯著增高，左心室前壁局域血流量也顯著增加，說明基因轉染成肌細胞治療骨骼肌系統和心血管疾病是可行且高效的。

2 成肌細胞治療心血管系統疾病

骨骼肌纖維與心肌細胞同為橫紋肌，都起源于中胚層，分化過程有相似之處，經體外培養可得到大量可供移植的成肌干細胞。自體骨骼肌成肌細胞移植可避免免疫排斥反應，不存在醫學倫理問題。骨骼肌成肌細胞植入體內后，可存活于缺血組織中，且不會無限增殖或形成腫瘤。將骨骼肌成肌細胞直接注入損傷心肌，能產生心肌細胞樣的收縮與舒張。研究證明，成肌細胞可用于治療缺血性心臟病，如心肌梗死和頑固性心力衰竭等。Tambara等[5]將新鮮分離的成肌細胞（未經培養擴增）植入梗死后的大鼠心肌，發現足量的成肌細胞移植后，能存活并定位于宿主受損心肌，分化成肌管，新生的肌組織占據了絕大多數心肌梗死區域，從而改善了心功能。另外，Gavira等[6]以豬為模型，研究成肌細胞在治療慢性心梗方面的療效，他們把20只豬分成4組，在6周內分別注射不同數量的骨骼肌成肌細胞，進行7個月的觀察，發現實驗組心臟功能明顯好于對照組。3個劑量單位注射豬的左室射血分數（Left ventricular ejection fraction,LVEF）明顯高于1個劑量單位注射豬。實驗表明，盡管成肌細胞移植后出現心律失常，反復和/或大劑量注射成肌細胞于心肌受損部位，能顯著改善宿主心功能，臨床應用前景廣闊。Murry等[7]觀察到成肌細胞在植入成年大鼠缺血心肌2周后，表達慢收縮細胞的標志物肌球蛋白重鏈β（β-MHC），而不表達心肌細胞特異的標志物肌球蛋白重鏈α（α-MHC），并最終在心肌瘢痕內轉變為抗疲勞的慢反應纖維，以適應心臟的生理功能。說明移植的成肌細胞并未分化成心肌細胞,而是分化為能負擔心臟工作的慢收縮細胞。雖然無法證實成肌細胞可分化為心肌細胞，但以多種動物為研究對象、不同心梗模型（冷凍、動脈結扎及毒性藥物）的多種試驗，均可證明成肌細胞移植可使心功能得到改善。Taylor等[8]以羊為研究對象，用蛇毒注射至左室壁內形成心梗模型，3周后超聲心動圖檢測其收縮功能；然后取自體骨骼肌成肌細胞移植，2個月后左室收縮功能證實較月前有所提高。Pouzet等[9]以小鼠為研究對象，在自體成肌細胞移植后2個月和1年時檢測左室射血分數，證實兩個時間點無明顯差別，說明成肌細胞移植后對心功能的提供作用是長期的。

目前的臨床試驗并不支持成肌細胞移植對心梗的治療效應。Philippe等[10]將心臟病患者隨機分成低劑量組、高劑量組和安慰劑對照組。這些患者均有左心室功能障礙并伴有心肌梗死，具備冠狀動脈手術指征。所有患者均接受了植入式心臟轉復除顫器，97例接受成肌細胞注射（400或800萬個；n=33和n=34）或安慰劑（n=30）。然而結果表明成肌細胞注射并沒有改善心臟功能，可能是移植細胞因缺血、凋亡而導致移植失敗。

骨骼肌成肌細胞是具有廣闊應用前景的一種干細胞，也是修復心肌缺損時優先考慮的種子細胞。近年來，動物實驗取得了一些令人鼓舞的成果，多數研究證明，植入細胞改善左室功能和逆轉心室重塑，可能源于其在壞死心肌內形成了肌管。關于成肌細胞在心梗治療的臨床應用上，目前主要存在3個障礙：第一，移植后導致的心律失常；第二，植入細胞存活率低；第三，成肌細胞植入機體后存在變異性。雖然成肌細胞在體外易于培養和擴增，但體外擴增需要時間，因此對急性心肌梗死的患者來說使用自體成肌細胞移植目前仍不現實[11]。

盡管面臨著諸多問題，但成肌細胞移植技術作為治療心肌梗死的一種嶄新手段，顯示了其具有的治療潛力。隨著對分化調控、信號轉導、歸巢分子機制等研究的深入以及更多的大規模、臨床隨機雙盲對照實驗的開展，成肌細胞移植將為心肌梗死等疾病的治療帶來新的希望

3 成肌細胞治療壓力性尿失禁

尿道固有括約肌缺陷（Intrinsic sphincter deficiency，ISD）是導致女性壓力性尿失禁（Stress urinary incontinence，SUI）的重要原因。目前對ISD導致的SUI尚無長期有效的治療方法。由于ISD患者的尿道括約肌存在收縮功能障礙，進行肌肉干細胞移植可能是治療SUI的最佳方法。其中成肌細胞具有增殖快、融合慢、多向分化潛能等特性，移植后存活率高，是一種理想的細胞移植物[12]。

Strasser等[13]選擇42名女性和21名男性，接受經尿道超聲引導自體成肌細胞和肌成纖維細胞的注射治療，其中成肌纖維細胞注入尿道粘膜，成肌細胞注射入尿道橫紋肌。把這些接受治療的病人隨機地分為兩組。同時，7名男性和21名女性患者接受膠原注射治療以作為對照組。經過12個月的隨訪，自體細胞注射治愈了39名女性和11名男性的尿失禁癥狀，生活質量評分從術前的51.38提高到術后的104.06。尿道橫紋肌由術前的2.103 mm增厚到3.303 mm，并伴有收縮功能增強。術后的結果表明，在尿道橫紋肌內有新的肌肉組織形成，但常規的膠原注射只治愈了2例患者。需要強調的是，超聲引導在這種治療中起著關鍵作用，傳統的內鏡操作不能夠準確定位，因此影響自體細胞移植的治療效果。男性和女性治療結果的不同，在一定程度上是源于男性前列腺切除術后的影響。另外，這種治療方法對放射治療以及術后出現尿路瘢痕的患者無效。結果證實，成肌細胞移植可以用于治療尿失禁，但遠期效果尚有待更長時間的觀察隨訪。理想的注射細胞數量和注射后對膀胱功能的遠期影響也需要進一步研究。

4 成肌細胞治療骨骼肌疾病

利用傳統方法治療骨骼肌嚴重損傷和許多遺傳性肌病（如肌營養不良癥等）效果不佳。作為肌肉前體細胞，成肌干細胞在骨骼、肌肉系統被廣泛應用，可用于修復損傷的骨骼、關節和肌肉組織[14－15]。

成肌細胞是目前已知的哺乳動物體內唯一能大量分裂、增殖及遷移的肌組織前體細胞，具有與宿主肌纖維融合的能力，可作為有效載體廣泛用于特定目的基因的轉移，從而參與遺傳性肌病的基因治療。

成肌細胞移植較早用于某些遺傳性肌病的基因治療，如Duchenne肌營養不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）。Duchenne肌營養不良癥是一種X-性連鎖隱性遺傳肌病，男性發病率為1/3 500，居神經遺傳病之首。病因主要是X染色體短臂2區1帶（Xp21）基因突變導致細胞膜骨架蛋白-抗肌萎縮蛋白（Dystrophin，Dys）缺乏所致，其病程進展快，預后差，目前臨床尚無有效治療方法[16]。細胞和基因工程治療給DMD患者帶來了希望，王訓等[17]以Duchenne肌營養不良癥模型－mdx鼠為模型進行成肌細胞移植，術后1個月、2個月、3個月分別取實驗鼠的四肢骨骼肌，運用免疫熒光法檢測抗肌萎縮蛋白的表達情況。結果表明，成肌細胞肌肉注射移植能夠在一定程度上修復mdx鼠的萎縮肌組織，能否改善鼠的運動機能還需進一步研究。劉立斌等[18]以mdx小鼠為模型進行成肌細胞移植，術后4周采用一次性游泳力竭實驗檢測小鼠運動能力，取材行HE染色及5-BrdU、結蛋白、Dys免疫組織化學染色觀察及圖像分析。實驗證實，移植的成肌細胞移植后，能在宿主體內存活并與宿主骨骼肌細胞融合，起到了一定的治療作用。通過一次性游泳力竭實驗證實，成肌細胞移植治療后mdx小鼠的運動能力具有顯著改善。作為治療方法的一種，成肌細胞移植可以治療DMD，但成肌細胞治療存在融合性差及體內存活率低等問題，在將來的成肌細胞移植研究中，應該在基因修飾、趨化因子以及細胞間相互影響使之融合的技術等方面尋求突破，增加成肌細胞治療的成功率。

在日常生活和體育鍛煉中，肌肉損傷難免發生。肌肉一旦損傷，需要經歷修復和再生過程。而成肌細胞對骨骼肌的修復和再生的發生、發展、轉歸的過程研究，對骨骼肌損傷后的治療和康復治療具有重要意義。Irintcher等[19]將培養的成肌細胞移植到凍傷骨骼肌中，可改善肌肉收縮功能。成肌細胞移植也被用于治療肛門失禁，Ryoko等[20]利用差速貼壁分離法分別從1 d、1、2、3、4、8和12周的雌性小鼠獲取成肌細胞，注射至大腿和肛提肌損傷的小鼠。免疫熒光檢測證實，受損的下肢肌內出現新生的肌纖維，肛提肌內也出現融合肌管，成肌細胞移植為肛門直腸畸形修復手術后引起的大便失禁的治療提供了新的思路。

隨著對骨骼肌成肌細胞功能的深入了解和研究，會對成肌細胞在骨骼肌再生過程中的作用有更具體、準確的理解和認識，為骨骼肌損傷、遺傳性骨骼肌疾病等提供更安全、高效的治療方法。

5 成肌細胞臨床應用的展望

隨著細胞生物學、分子生物學技術的不斷發展，成肌細胞移植技術日趨成熟。為許多利用傳統方法治療效果不理想的疾病，如心肌梗死、壓力型尿失禁、DMD等提供了全新的治療方法，但目前相當多的研究只限于動物模型，尚需進一步進行臨床應用型研究。此外，細胞移植所引起的免疫反應、細胞融合率、長期的臨床效果以及細胞移植所產生的并發癥等都需要進行仔細觀察和分析。我們相信，隨著上述問題的解決，成肌細胞移植將在多種疾病的治療上發揮重要作用，成為一種簡便、安全、高效的治療方法。

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Q813

B

1673－0364（2010）05－0295－03

2010年6月17日，

2010年7月30日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.05.017

國家自然科學基金項目(30771045)。

510515廣東省廣州市南方醫科大學解剖學教研室。