HPLC-MS/MS法分析大鼠體內淫羊藿素葡糖醛酸結合物

劉海培,孟繁華,郭繼芬,司端運,朱曉薇,趙毅民

(1.軍事醫學科學院毒物藥物研究所,北京 100850;2.天津中醫藥大學,天津 300193;3.天津藥物研究院,天津 300193)

HPLC-MS/MS法分析大鼠體內淫羊藿素葡糖醛酸結合物

劉海培1,2,孟繁華1,郭繼芬1,司端運3,朱曉薇2,趙毅民1

(1.軍事醫學科學院毒物藥物研究所,北京 100850;2.天津中醫藥大學,天津 300193;3.天津藥物研究院,天津 300193)

應用高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)法鑒別大鼠血漿及尿糞中淫羊藿素葡糖醛酸結合物。生物樣品經固相萃取法處理后,以V(乙腈)∶V(水)∶V(乙酸)=45∶55∶1.5為流動相,通過Dikma C18柱分離,采用電噴霧離子四極桿串聯質譜在負離子檢測方式下進行一級和二級全掃描質譜分析。通過提高離子源內的DP電壓,使待測物發生源內裂解產生碎片離子,再對產生的碎片離子進行子離子掃描,可獲得相當于三級質譜分析的結果。根據待測物的色譜和質譜信息,發現淫羊藿素在大鼠體內可代謝為1種雙葡糖醛酸結合物M 1和2種單葡糖醛酸結合物M 2、M 3。大鼠灌胃給予淫羊藿素后,在血漿和尿樣中可檢測到M 1、M 2和M 3,在糞便中僅檢測到M 2和M 3。

高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-M S/M S);淫羊藿素;葡糖醛酸結合物;代謝產物

淫羊藿素(icaritin,ICT)為來源于小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(Epimedium)植物的一種黃酮類成分,也可由淫羊藿苷經纖維素酶水解得到,能明顯降低黑色素的濃度[1],且具有促進MCF27細胞和T47D細胞增殖的雌激素樣作用[2],其結構示于圖1。為了了解淫羊藿素的體內過程,我們已建立了 HPLC-MS/M S法[3]測定血漿樣品中淫羊藿素的濃度,并將此方法應用到藥代動力學研究中。灌胃給予大鼠80 mg·kg-1淫羊藿素后,血漿中結合型淫羊藿素的Cmax和AUC0-∞分別約為原形的44倍和23倍,提示淫羊藿素在大鼠體內主要以結合物形式存在。在上述研究的基礎上,本工作采用高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/M S)法對淫羊藿素在大鼠血漿、尿、糞中的代謝產物進行分析,發現淫羊藿素在大鼠體內可代謝為1種雙葡糖醛酸結合物M 1和2種單葡糖醛酸結合物M 2、M 3。

圖1 淫羊藿素的結構Fig.1 Structure of icaritin

1 實驗部分

1.1 儀器

API3000液相色譜-串聯質譜儀:美國 AB公司產品,配有 Turbo Ionsp ray離子化源;Agilent 1100四元梯度泵和自動進樣器:美國安捷倫公司產品。

1.2 試劑和材料

淫羊藿素對照品(99.9%):由天津藥物研究院提供;抗壞血酸(分析純):購自北京化學試劑公司;乙腈(色譜純):購自美國 Sigma公司;乙酸(色譜純):購自美國 Tedia公司;甲醇(色譜純):購自美國Fisher公司;Bakerbond固相萃取柱(C18,100 mg/1 mL):購自美國Baker公司。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件 Dikma C18柱(200 mm×4.6 mm×5μm):美國 Dikma公司產品;C18保護柱(4 mm×3.0 mm):美國 Phenomenx公司產品;流動相為V(乙腈)∶V(水)∶V(乙酸)=45∶55∶1.5;流速 0.6 mL ·min-1;進樣量 50 μL;柱溫25 ℃。

1.3.2 質譜條件 電噴霧離子源,負離子檢測,噴射電壓-4 000 V,源溫度400℃,霧化氣為6 unit,卷簾氣為11 unit,碰撞氣為7 unit,采用一級和二級全掃描質譜法分析。

1.4 樣品處理

取200μL生物樣品(血、尿、糞),50μL 2.5 g·L-1抗壞血酸溶液和100μL磷酸二氫銨緩沖溶液(p H 3.99),加入200μL純凈水,渦流3 min,離心 10 min(9 500 r·min-1),取上清液至已活化好的 SPE C18柱,先用2×1 m L水沖洗,再用2×1 m L甲醇洗脫,將甲醇洗脫液于40℃下空氣吹干。殘余物用150μL流動相溶解后,吸取50μL進行 HPLC-M S/M S分析。

2 結果與討論

負離子檢測模式下,在大鼠灌胃給藥后的血樣和尿樣一級全掃描色譜圖上均可檢測到1個準分子離子m/z737(M 1)和2個準分子離子m/z561(M 2和M 3)的色譜峰。在糞樣的一級色譜圖上檢測到2個準分子離子m/z561(M 2和M 3)的色譜峰。M 1的相對分子質量比原形藥物多2×176 u,M 2和M 3的相對分子質量比原形藥物均多 176 u。色譜保留時間順序為tR(M 1)＜tR(M 2)＜tR(M 3)＜tR(icaritin)。初步推測 M 1為淫羊藿素的雙葡糖醛酸結合物,M 2和M 3為淫羊藿素的單葡糖醛酸結合物。

對m/z737(M 1)和m/z561(M 2和 M 3)繼續進行二級質譜分析,相應的二級全掃描色譜圖和質譜圖示于圖2和圖3。在M 1的二級質譜圖中,有基峰為m/z737脫去一分子葡糖醛酸(176 u)后的m/z561,還有脫去二分子葡糖醛酸后的m/z385,以及葡糖醛酸離子m/z175和m/z113。m/z385與淫羊藿素在負離子模式下的準分子離子相同。有文獻[4-5]報道,在負離子模式下,碎片離子m/z175和其脫去一分子水和一分子二氧化碳后的m/z113可以作為確定藥物葡糖醛酸結合物的直接證據,據此推定M 1為淫羊藿素的雙葡糖醛酸結合物。在M 2和M 3的二級質譜圖中,基峰均為m/z561脫去一分子葡糖醛酸后的m/z385,另外還均有m/z175和m/z113離子,因此推定M 2和M 3為淫羊藿素的單葡糖醛酸結合物。

為進一步證明M 1、M 2和M 3的二級質譜中所產生的碎片離子m/z385為原形藥物淫羊藿素的碎片離子,還需對其進行下一級質譜分析。但由于三重四極桿質譜儀只能進行二級質譜分析,因此通過將離子源內的DP電壓由70 V提高到160 V,使M 1、M 2和M 3在離子源內裂解產生m/z385碎片,然后使m/z385在第2個四極桿(即碰撞室)中發生碰撞誘導裂解,獲得相當于三級質譜分析的結果。在淫羊藿素對照品的二級質譜圖中發現,淫羊藿素脫去B環3’位甲基后的m/z370、脫去C環8位2-羥基-2-甲基丙基后的m/z311、脫去B環3’位甲基和C環8位2-羥基-2-甲基丙基后的m/z297等碎片離子。將M 1、M 2和M 3的三級質譜圖與淫羊藿素對照品的二級質譜圖進行比較,發現它們具有相同的質譜裂解特征,示于圖4,因此進一步證明了M 1、M 2和M 3是淫羊藿素的葡糖醛酸結合物。M 2和M 3具有相同的相對分子質量和質譜裂解碎片,但色譜保留時間不同,說明M 2和M 3為同分異構體。

圖2 灌胃給予大鼠淫羊藿素后尿樣中M 1、M 2和M 3的二級全掃描色譜圖a.空白尿樣;b.灌胃給予80 mg·kg-1淫羊藿素后的大鼠尿樣Fig.2 Product ion scan chromatograms spectra of M 1,M 2 and M 3 in rat urine after oral administration a.blank urine sample;b.urine sample obtained after oral administration of 80 mg·kg-1 icaritin

圖3 M 1、M 2和M 3的二級全掃描質譜圖Fig.3 Product ion scan spectra of M 1,M 2 and M 3

圖4 淫羊藿素的二級質譜圖及代謝物的三級質譜圖a.淫羊藿素的二級質譜圖;b.M 1的三級質譜圖;c.M 2和M 3的三級質譜圖Fig.4 product ion scan spectra of icaritin and full scan MS3 spectra of con jugates a.product ion scan spectrum of icaritin;b.MS3 spectrum of M 1;c.MS3 spectrum of M 2 and M 3

鑒于不易得到葡糖醛酸結合物對照品,我們只能依靠質譜信息對M 1、M 2和M 3的化學結構進行推測。淫羊藿素結構中含有4個羥基,其中包括3個酚羥基(黃酮母核的 3,5,7位)和1個醇羥基。據文獻[6]報道,酚羥基較醇羥基的反應活性強,而黃酮類化合物的酚羥基反應順序通常為7位＞3位＞5位。因此推測M 1為淫羊藿素的3,7位羥基與葡糖醛酸結合而成的代謝產物;M 2和M 3為淫羊藿素的3,7位羥基分別與葡糖醛酸結合而成的代謝產物,但具體結合位點還有待進一步研究。

[1]PARK J S,PARK H Y,RHO H,et al.Statistically designed enzymatic hydrolysis for op timized production of icariside IIas a novel melanogenesis inhibito r[J].J Microbiol Biotechnol,2008,18(1):110-117.

[2]葉海涌,劉 健,樓宜嘉.淫羊藿苷衍生物的制備及其雌激素樣作用研究[J].浙江大學學報,2005,34(2):131-136.

[3]劉海培,孟繁華,郭繼芬,等.高效液相色譜-串聯質譜法測定大鼠血漿中淫羊藿素[J].藥學學報,2009,44(10):1 140-1 144.

[4]王 玲,王英武,陳 剛,等.電噴霧-串聯四極桿-飛行時間質譜法測定藥物的葡萄糖醛酸結合物[J].質譜學報,2002,23(2):93-95.

[5]邢 杰,陳笑艷,張淑秋,等.液相色譜-電噴霧離子阱質譜法分析大鼠尿樣中的黃芩苷及其異構體[J].質譜學報,2004,25(3):129-133.

[6]MOHAM ED B,STéPHANE L,AZIZ A,et al.Hemisynthesis of all the O-monomethylated analogues of quercetin including the major metabolites,through selective p rotection of phenolic functions[J].Tetrahedron 2002,58:10 001-10 009.

Analysis of Glucuronide Conjugates of Icaritin in Rat by LC-MS/MS

L IU Hai-pei1,2,M ENG Fan-hua1,GUO Ji-fen1,SIDuan-yun3,ZHU Xiao-wei2,ZHAO Yi-m in1
(1.Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Sciences,Beijing 100850,China;2.Tianjin University of Traditiona l Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;3.Tianjin Institute of Pharmaceutical Research,Tianjin 300193,China)

The glucuronide conjugates of icaritin in rat plasma,urine and feces were analyzed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-M S/MS).Samples were extracted using C18solid-phase extraction cartridges,and then separated on a Dikma C18column.Themobile phase was consisted ofV(acetonitrile)∶V(water)∶V(acetic acid)=45∶55∶1.5.Electrosp ray ionization(ESI)source was app lied.Full scan and second stagemass scan were performed in the negative ion mode.According to the chromatography and MS data,a di-glucuronide conjugate(M 1)and two mon-glucuronide conjugates(M 2 and M 3)of icaritin are identified in rat.M 1,M 2 and M 3 can be detected in plasma and urine,while M 2 and M 3 can be found in feces after oral administration of icaritin to rat.

high performance liquid chromatographic-tandem mass spectrometry(HPLCM S/M S);icaritin;glucuronide conjugate;metabolite

郭繼芬,女(漢族),內蒙林西人,副研究員,藥物分析專業。E-mail:guojifen@sohu.com

O 657.63

A

1004-2997(2010)06-0376-04

2009-12-31;

2010-06-13

國家自然科學基金(81001468)資助

劉海培(1983～),女(漢族),河北衡水人,碩士研究生,藥物分析專業。E-mail:liuhaipei2007@163.com