LC/MS技術在發(fā)現(xiàn)和鑒定藥物中有關物質(zhì)的應用

王鵬遠,張金蘭

(中國醫(yī)學科學院 &北京協(xié)和醫(yī)學院,藥物研究所,北京 100050)

LC/MS技術在發(fā)現(xiàn)和鑒定藥物中有關物質(zhì)的應用

王鵬遠,張金蘭

(中國醫(yī)學科學院 &北京協(xié)和醫(yī)學院,藥物研究所,北京 100050)

論述了LC/MS技術在發(fā)現(xiàn)和鑒定藥物中有關物質(zhì)的應用特點,比較和討論不同原理質(zhì)量分析器在藥物雜質(zhì)鑒定中的適用范圍和優(yōu)缺點,并總結(jié)了近幾年LC/MS技術在藥物有關物質(zhì)分析中的應用實例。

液相色譜-質(zhì)譜(LC/MS);四極桿質(zhì)譜;飛行時間質(zhì)譜;離子阱質(zhì)譜;雜質(zhì)鑒定

有關物質(zhì)主要是指在藥物生產(chǎn)過程中帶入的原料、中間體、降解物、異構(gòu)體、聚合體和副反應產(chǎn)物等,它們的存在對藥物的質(zhì)量和安全有顯著影響。人用藥物注冊技術要求國際協(xié)調(diào)會(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human U se,ICH)明確指出:“對于每日最大劑量≤2 g的藥物,其表觀含量在0.1%或者每日最大攝入量為1 mg及其以上的雜質(zhì),須鑒定其結(jié)構(gòu);而對于每日最大劑量＞2 g的藥物,當雜質(zhì)的表觀含量在0.05%及其以上,就必須鑒定其結(jié)構(gòu)”[1-2]。因此,隨著醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)新藥研制速度的不斷加快,需要快速、靈敏、準確的雜質(zhì)鑒定方法來滿足日益增長的新藥研發(fā)速度,保障藥物的安全性。

目前,液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry,LC/M S)因其卓越的靈敏度、高選擇性和快速的特點已成為藥物中微量有關物質(zhì)分析的首選技術。對于成分復雜的藥物,使用LC/M S技術可以不經(jīng)復雜的分離和純化步驟即可獲得樣品的色譜和質(zhì)譜信息,特別是多級質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜技術的發(fā)展和應用,能夠在線獲得化合物的豐富片段信息和分子組成信息,為藥物中有關物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定提供了快速、準確的方法。當然,在沒有對照品的情況下,要最終確定雜質(zhì)結(jié)構(gòu)還需要通過分離富集制備或者定向合成等途徑獲得該雜質(zhì)單體,然后進行NMR、IR、X-ray衍射分析來確證其結(jié)構(gòu)。本文將著重論述LC/M S在發(fā)現(xiàn)和鑒定藥物中有關物質(zhì)的應用特點。

1 離子化方式

大氣壓電離源(atmospheric p ressure ionization,API)有效解決了常壓運行下輸出液態(tài)組分的LC與真空條件下進行氣態(tài)組分檢測的M S之間的接口問題,這為LC/M S強大功能的發(fā)揮奠定了技術基礎。目前API主要包括電噴霧離子源(electrosp ray ionization,ESI)和大氣壓化學離子源(atmospheric p ressure chemical ionization,APCI),其中,ESI是先帶電、再噴霧,帶電液滴在去溶劑化過程中形成離子而被檢測,適合分析極性大的化合物;而APCI是先成霧、后放電,在電暈針產(chǎn)生的高壓電弧下溶劑分子發(fā)生電離,再與樣品分子發(fā)生分子離子反應,從而形成離子進行檢測,適合分析極性小的樣品。二者都屬于軟電離技術,非常容易形成化合物的準分子離子峰,這對獲得化合物的相對分子質(zhì)量信息很有幫助。ESI的軟電離程度較APCI的要小,但其應用范圍較APCI大,只有少部分化合物在ESI離子源內(nèi)電離程度差,可以用A PCI離子源輔助解決問題,另外APCI離子源可以對LC流速高達2 m L·min-1的組分直接進行分析,省去分流的繁瑣。

由于API包含 ESI和APCI兩種不同的離子源,而每種源的離子檢測模式又分為正離子和負離子,這樣組合起來共有4種檢測方式,其中必然有一種適合藥物中有關物質(zhì)的分析,特別是對于未知雜質(zhì),將4種檢測方式獲得的信息綜合起來進行比較分析,能更加確定對未知化合物結(jié)構(gòu)的推斷。

2 離子分離方式

樣品經(jīng)過離子化后須在質(zhì)量分析器中按照質(zhì)荷比的不同進行分離,目前,LC/M S中常用的質(zhì)量分析器有四極桿(quadrupole)、飛行時間(time of flight,TOF)、離子阱 (ion trap,IT)等

類型,每一種都有其優(yōu)勢和局限,實際工作中要根據(jù)需要選擇最合適的類型。

2.1 單一型質(zhì)譜

2.1.1 四極桿質(zhì)譜 四極桿質(zhì)量分析器相當于一個質(zhì)量過濾器,當在極桿上施加一定的直流和射頻電場時,四極桿只允許一定質(zhì)荷比的離子通過檢測器,而其他質(zhì)荷比的離子因為運動路徑不穩(wěn)定而撞擊在四極桿上不能被檢測。四極桿質(zhì)譜結(jié)構(gòu)簡單、價格便宜、體積小巧,具有較好的重現(xiàn)性,但其分辨率較低,隨著掃描范圍逐漸增大,其靈敏度逐漸下降,一般只能獲得化合物的相對分子質(zhì)量信息,對含量較低的雜質(zhì)組分則無法檢測[3]。實際應用中經(jīng)常作為混合型質(zhì)譜的前級分析器(如Q-IT,Q-TOF等)用于母離子選擇或者發(fā)揮離子聚焦等導向功能。目前在藥物有關物質(zhì)分析中僅用于初級的相對分子質(zhì)量識別[4]。

2.1.2 飛行時間質(zhì)譜 飛行時間質(zhì)量分析器通過測定離子從源到檢測器的飛行時間,再根據(jù)該時間與離子質(zhì)荷比的函數(shù)關系進行數(shù)學換算,從而檢測離子。因為其掃描速度非常快,靈敏度極高,而且理論上掃描范圍可以無限大,非常適合各種藥物中有關物質(zhì)的分析。可是,由于離子從源出發(fā)的起始時間和初始動能不盡相同,使其分辨率大打折扣,為了解決這一缺陷,人們在 TOF上引進了一項稱為“延遲引出”(delay extraction,DE)技術或稱“脈沖離子引出”(pulse ion extraction,PIE)技術[5],通過選擇適當?shù)难舆t時間及控制靶與引出電極間的電位差,可以有效地補償離子初始動能的分散,從而顯著地提高飛行時間質(zhì)譜儀的分辨率。另一種方法是使用離子反射器(reflectron)[6],動能大的離子“刺入”反向靜電場較深,反之較淺,從而保證質(zhì)荷比相同而動能不同的離子能在相同時間到達檢測器,使分辨率得到極大提高。

TOF作為一種價格適中,維護簡單的高分辨質(zhì)譜在藥物的有關物質(zhì)鑒定中發(fā)揮著重要作用。Provera等[7]在某新型促皮質(zhì)激素釋放因子拮抗劑的研究中,將含量較小,無法在常規(guī)液相良好分離的雜質(zhì),通過半制備液相分離出一定量單體,然后進行 TOF分析,獲得該雜質(zhì)的HRM S數(shù)據(jù),結(jié)合合成工藝的信息以及 NM R數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)。由于 TOF屬于性價比較高的高分辨質(zhì)譜,因此在 HRM S領域應用非常廣泛,在藥物有關物質(zhì)的分子組成測定方面應用也很普遍[9-13]。

2.1.3 離子阱質(zhì)譜 離子阱質(zhì)量分析器分為動態(tài)和靜態(tài)兩種類型,前者包括三維離子阱和線性離子阱(linear ion trap,L IT),后者主要是指離子回旋共振質(zhì)譜(ion cyclotron resonance,ICR)。

三維離子阱與四極桿很相似,如果將四極桿質(zhì)量分析器的兩端加上合適的電場將其封上,則四極桿內(nèi)的離子將受到正交的3個方向電場力的共同作用而較長時間的呆在穩(wěn)定區(qū)內(nèi),就像一個電場勢阱[14]。離子阱質(zhì)譜掃描迅速,可以將感興趣的母離子“捕獲”在阱內(nèi),再通過碰撞誘導解離(collison induced dissociation,CID)獲得子離子,然后再“捕獲”感興趣的子離子進行 CID分析,如此反復,從而獲得目標化合物充足的多級質(zhì)譜數(shù)據(jù),為結(jié)構(gòu)鑒定提供充分信息。三維離子阱結(jié)構(gòu)簡單、性價比高,靈敏度較四極桿質(zhì)量分析器提高10～1 000倍,而且擁有優(yōu)異的多級質(zhì)譜測定能力,因而定性能力很強。

Dongre等[15]使用離子阱質(zhì)譜儀LCQ對某磷酸哌喹原料藥進行LC/MSn分析,獲得雜質(zhì)和主成分的準分子離子峰及M Sn數(shù)據(jù),結(jié)合合成路線的起始原料和中間體及反應條件,并根據(jù)氯元素同位素豐度分布推斷氯原子個數(shù),判斷可能的基團變化,推斷出雜質(zhì)最可能的結(jié)構(gòu),然后定向合成、分離純化,獲得推斷的可能雜質(zhì)的單體,進行LC/M Sn和NMR以及IR驗證,最終確定其結(jié)構(gòu)。John等[16]在分析不同廠家和不同國家的氫氯噻嗪原料藥時發(fā)現(xiàn)一個未報道的雜質(zhì),采用離子阱質(zhì)譜儀LCQ進行LC/M S和LC-M S/M S分析,獲得一級和多級質(zhì)譜信息,從而推斷出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。Francese等[17]在研究葉酸鈣過程中發(fā)現(xiàn)一種有關物質(zhì),通過離子阱質(zhì)譜儀LCQ進行LC-M S/M S分析,發(fā)現(xiàn)該有關物質(zhì)與葉酸的M Sn數(shù)據(jù)非常一致,只是[M+H]+相差1 u,提示該雜質(zhì)的相對分子質(zhì)量比葉酸小1 u,根據(jù)裂解途徑的一致性可以推斷二者只在氨基酸側(cè)鏈部分有區(qū)別,再根據(jù)氮律規(guī)則,可以推測未知雜質(zhì)的側(cè)鏈部分為谷氨酸,最后用合成途徑獲得該物質(zhì),進行結(jié)構(gòu)驗證。Dongre等[18]通過LC/M S法分析氟康唑原料藥時發(fā)現(xiàn)了3個有關物質(zhì),其中有2個結(jié)構(gòu)未曾報道,由離子阱質(zhì)譜儀LCQ獲得LC-M S/M S數(shù)據(jù),歸納出未知雜質(zhì)與氟康唑在多級質(zhì)譜上的異同,推斷出其可能的結(jié)構(gòu),然后對原料藥進行制備、分離,得到雜質(zhì)單體,再進行 IR、NM R分析,確證結(jié)構(gòu)。Raman等[19]使用 HPLC方法從西酞普蘭中檢測到1個雜質(zhì),通過LC-IT M S獲得多級質(zhì)譜數(shù)據(jù),比較該雜質(zhì)與主成分質(zhì)譜裂解途徑的區(qū)別,同時借助Q-TOF獲得高分辨數(shù)據(jù),對其結(jié)構(gòu)進行推測,最后通過液相分離制備得到該雜質(zhì)的純品,進而分析其NMR、IR光譜,最終確定該雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

線性離子阱相比三維離子阱其阱腔體積增大很多,具有雙檢測器,而且掃描循環(huán)時間大大減少,從而使其靈敏度比三維離子阱提高1個數(shù)量級,可以獲得更高的采集速度、更高的分辨率和更高質(zhì)量的M Sn譜圖[20]。本課題組人員在鑒定葛根素原料藥中有關物質(zhì)時,利用L IT卓越的靈敏度和多級質(zhì)譜能力,獲得了有關物質(zhì)RS1和 RS2的M S1～M S5數(shù)據(jù),二者的前四級質(zhì)譜數(shù)據(jù)幾乎完全相同,直到M S5時才出現(xiàn)不同的特征碎片離子,進而確定了羥基的取代位置[21]。L IT在掃描速度、靈敏度和分辨率上都較三維離子阱有顯著提高,其定性能力明顯增強,非常適合藥物中微量有關物質(zhì)結(jié)構(gòu)的確定。

離子阱質(zhì)譜強大的多級質(zhì)譜裂解能力有利于研究化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律,通過比較藥物主成分與有關物質(zhì)的多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)的異同,可以快速推斷有關物質(zhì)發(fā)生變化的基團數(shù)量和位置,為最終確定雜質(zhì)結(jié)構(gòu)提供可靠信息,因而離子阱質(zhì)譜技術在藥物中有關物質(zhì)結(jié)構(gòu)快速鑒定方面發(fā)揮著重要作用。

2.2 混合型質(zhì)譜

混合型質(zhì)譜是將兩種或兩種以上的質(zhì)譜串聯(lián)起來,從而充分發(fā)揮各種質(zhì)譜的優(yōu)勢,提高離子的選擇性。常見的混合型質(zhì)譜由2個質(zhì)譜串聯(lián)而成,其中第一級質(zhì)量分析器(M S1)將離子預掃描或者導向聚焦,由第二級質(zhì)量分析器(M S2)分析結(jié)果。混合型質(zhì)譜按照M S1類型的不同主要可分為MS1為四極桿質(zhì)量分析器和M S1為離子阱質(zhì)量分析器兩類。

2.2.1 M S1為四極桿質(zhì)量分析器 三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(QqQ)是目前廣泛應用的一種混合型質(zhì)譜,其第一級和第三級四極桿分別為M S1和M S2,第二級四極桿分析器所起的作用是將從M S1得到的各離子峰進行碰撞誘導解離產(chǎn)生子離子,然后進入M S2再進行分析,相當于一個碰撞反應池。采用選擇性離子反應監(jiān)測(SRM)時,QqQ由于經(jīng)兩重質(zhì)量分離和中間的碰撞誘導解離(CID),具有突出的專屬性和靈敏度優(yōu)勢,同時它具有子離子掃描、母離子掃描、中性丟失掃描和全掃描等多種掃描方式,在微量物質(zhì)的定性測定方面比較有特點。QqQ的高穩(wěn)定性使其在定量分析上的應用更為廣泛,但由于不是高分辨,且一般最多僅能給出M S2數(shù)據(jù),使其在結(jié)構(gòu)定性方面稍顯不足,特別對于藥物中有關物質(zhì)的鑒定往往要借助其他光譜技術手段來確定。Bharathi等[22]在對鹽酸克林霉素棕櫚酸酯原料藥的雜質(zhì)鑒定中,由于LC-QqQ M S只能獲得二級譜圖,在得到主要碎片離子質(zhì)荷比差異的基礎上還需將雜質(zhì)通過制備分離出來,然后進行NM R、IR分析確定結(jié)構(gòu)。Rok等[23]使用LCQqQ M S方法從慶大霉素中分離出17種雜質(zhì),根據(jù)雜質(zhì)對照品及其裂解規(guī)律推斷出主成分慶大霉素的裂解途徑,從而推斷出其他雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。由于能夠買到大部分雜質(zhì)對照品,因此能從有限的M S2信息中獲得雜質(zhì)的特征碎片離子信息,為雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推斷提供依據(jù)。

四極桿-飛行時間質(zhì)譜(Q-TOF)是由四極桿質(zhì)譜和飛行時間質(zhì)譜組成的串聯(lián)型質(zhì)譜儀,因此無論是在M S或M S/MS模式下均具有較高的分辨率和質(zhì)量精確度。在M S模式下,四極桿具有離子導向作用,發(fā)揮離子分離作用的是TOF MS部分;在M S/MS模式下,第一級四極桿質(zhì)譜具有離子選擇功能,通過選取單一離子并將其送入碰撞活化室與惰性氣體發(fā)生碰撞,從而使母離子發(fā)生誘導裂解,產(chǎn)生子離子再進入TOFMS進行質(zhì)量分離。這樣Q-TOF可以在進行M S2分析的同時對其進行高分辨測定,定性功能得到加強。Raman等[24]在合成抗抑郁藥物依澤替米貝過程中檢測到1個雜質(zhì),通過LCM S/MS分析獲得其 MSn數(shù)據(jù),并使用Q-TOF獲得其準確的分子質(zhì)量及分子組成信息,并推測出其結(jié)構(gòu),最后將該雜質(zhì)通過制備液相分離出來進行NM R、IR分析,從而確定其結(jié)構(gòu)。Li等[25]對于倍他地松-17-戊酸酯原料藥中能夠預測的有關物質(zhì),根據(jù)結(jié)構(gòu)特點推出堿水解的產(chǎn)物結(jié)構(gòu),然后使用Q-TOF M S觀察堿水解樣品的M S/MS和 HRM S數(shù)據(jù),再與理論上堿水解產(chǎn)物純品的M S/M S和 HRMS數(shù)據(jù)對比,若譜圖特征與理論預測一致,則說明雜質(zhì)結(jié)構(gòu)推斷正確性。Marko等[26]在分離鑒定辛伐他汀原料藥及其片劑中的有關物質(zhì)時,通過Q-TOF獲得辛伐他汀及其有關物質(zhì)的準分子離子峰和主要碎片離子的分子組成信息,比較已知主成分和未知雜質(zhì)在分子組成上的異同,可以確定未知雜質(zhì)與已知主成分結(jié)構(gòu)相同部分和不同部分,進而推斷其結(jié)構(gòu)。

四極桿-離子阱質(zhì)譜(Q-IT)是由四極桿和離子阱組成的混合型質(zhì)譜,當IT只進行一級掃描時,它可以充當QqQ使用;當Q作為離子導向作用時,它又可以作為IT M S使用,從而在同一臺質(zhì)譜上兼顧了藥物中微量組分定量分析與定性分析的功能。

2.2.2 MS1為離子阱質(zhì)量分析器 Dongrea等[27]在對氯喹和羥氯喹原料藥進行分析時,通過LC-IT M S獲得其有關物質(zhì)的M S和M Sn數(shù)據(jù),推斷出雜質(zhì)與原藥在M Sn上的特征性差異,并通過LC-TOF M S獲得有關物質(zhì)及碎片的精確分子質(zhì)量和分子組成信息,研究特征差異基團結(jié)構(gòu),進而推斷有關物質(zhì)結(jié)構(gòu)。該實驗在LC-IT M S和LC-TOF M S兩臺不同的質(zhì)譜上對同一藥物中的有關物質(zhì)進行分析,可能會因儀器不同產(chǎn)生的響應差異影響判斷,同時也耗費了較多的人力和物力,而離子阱-飛行時間質(zhì)譜(IT-TOF)將具有強大M Sn功能的離子阱質(zhì)譜與能夠測定精確分子質(zhì)量的 TOF串聯(lián)起來,原來的實驗可以在一次分析中完成,大大提高分析效率,這對藥物中有關物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定非常有利。姚勁挺等[28]采用超快速液相色譜和離子阱飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用,定性檢測出大米和菠菜陽性樣品中的19種農(nóng)藥。IT-TOF還可以用于中藥中微量組分的快速結(jié)構(gòu)鑒定[29]。

線性離子阱-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(L IT-FTICR M S)這種新的混合型質(zhì)譜綜合了L IT的穩(wěn)定性、多樣性、M Sn能力和 FT的高分辨、精確質(zhì)量測定能力,可以在獲得微量組分的多級質(zhì)譜碎片的同時對其進行分子組成的測定,所有工作在一次分析中完成,是目前鑒定藥物中有關物質(zhì)結(jié)構(gòu)效率最高的一種技術[30]。目前,由于其價格昂貴和維護成本高等原因限制了其廣泛應用,但近年來推出的線性離子阱-靜電場軌道阱質(zhì)譜(L IT-Orbitrap)在保留L IT-FT優(yōu)點的同時大大降低了生產(chǎn)和維護成本,相信會在藥物雜質(zhì)分析中發(fā)揮越來越重要的作用。

3 小結(jié)

LC/M S技術將高分離能力的LC技術和高定性能力的M S技術聯(lián)用起來,具有分析速度快、靈敏度高、專屬性好等優(yōu)點,已成為快速、準確發(fā)現(xiàn)和鑒定藥物中有關物質(zhì)的最佳方法。尤其是當今種類繁多、功能強大的質(zhì)譜檢測器的快速發(fā)展,為藥物中微量化合物的結(jié)構(gòu)鑒定提供了快速、靈敏、準確、多樣的解決方案。然而,LC/M S有時需要使用易揮發(fā)緩沖鹽系統(tǒng),經(jīng)常受藥劑中輔料影響產(chǎn)生離子化抑制現(xiàn)象,對于某些含有易氧化基團的化合物容易因熱分解、電化學等源內(nèi)誘導反應產(chǎn)生“偽雜質(zhì)”,從而影響真正雜質(zhì)的確定。總之,隨著科學技術的不斷進步,LC/M S技術正沿著高通量化、高精確化的方向發(fā)展,在未來藥物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定中將發(fā)揮更大的作用。

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Applications of LC/MS in Discovery and Characterization of Related Impurities in Drug

WANG Peng-yuan,ZHANG Jin-lan
(Institute of M ateria M edical,Chinese Academy of M edical Sciences and Peking Union M edical College,Beijing 100050,China)

App lication characteristics and research ideasof liquid chromatography-mass spectrometry(LC/M S)techniques in discovery and characterization of related impuritiesof durg were reviewed.The scope of app lication and strong and weak points of different mass analyzers used in characterization of drug related impurities w ere compared and discussed.The app lication samples of analysis in drug related impurities by LC/M S techniques w ere summarized in recent years.

liquid chromatography-mass spectrometry(LC/MS);quadrupole mass spectrometry;time-of-flightmass spectrometry;ion trap mass spectrometry;impurity structure characterization

O 657.63

A

1004-2997(2010)06-0362-06

201010-29-;

2010-11-11

衛(wèi)生行業(yè)科研專項項目(200802038)資助

王鵬遠(1985～),男,山西芮城人,碩士研究生,從事藥物分析研究。E-mail:wpy@imm.ac.cn

張金蘭(1969～),女,內(nèi)蒙古呼和浩特人,研究員,從事藥物分析研究。E-mail:zhjl@imm.ac.cn