云南馬關塘房桔炭疽病的病原分離和鑒定

張玉潔

(1.文山學院生化系,云南文山 663000;2.文山州生物資源開發研究中心,云南文山 663000)

塘房桔是近年來在云南省馬關縣境內選出并大量推廣種植的晚熟鮮食柑桔品種,春節前 1～2個月成熟。該品種果實扁圓形,平均單果重 20 g,最大果重 49 g。成熟后顏色鮮黃、皮薄緊繃、清香味濃,是當地特有品種。近十年來,塘坊桔已成為云南省馬關縣調整農業生產結構中一個新的經濟增長點,至 2007年底塘房桔的種植面積發展到 8 767畝,總產量達 950噸,總產值達 344萬元。隨著種植規模的迅速發展和種植時間的延長,原來的粗放管理改為園藝式的集約化栽培。由于栽培生態的變化和感病寄主的增加,致使塘房桔病害逐年加重。自 2007～2008年始柑桔炭疽病大規模流行。該病春季危害幼葉和幼果,夏、秋季節侵害各階段果實和葉子,導致大面積落葉、落果、形成空枝,產量急劇下降,整個地區塘房桔產業受到嚴重影響,2008年較上年減收約 200萬元,而且有逐年惡化的趨勢,成為生產上亟待解決的難題。2009年下半年,筆者對塘房桔炭疽病進行了系統的研究,報道了病原菌的分離鑒定結果。

1 材料和方法

1.1 病原分離

供試分離的塘房桔樣品隨機采自馬關塘房村的幾個桔園,共選 33個病果,采用馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂培養基 (PDA)進行組織分離培養。具體方法:取桔子典型病斑周圍具有菌絲擴散的組織,依次用 70%乙醇和 0.1%升汞進行表面消毒后置 PDA平板上培養,獲得來自病理組織的各種菌株。采用單孢分離法純化分離的菌株,記錄并統計各菌株出現頻率,編號后轉管于 PDA培養基,保存在 4℃冰箱內待鑒定。

1.2 菌株的促孢和擴繁及孢子和產孢結構的觀察鑒定

將純化的菌株分別轉接于各種類型促孢培養基上培養 5～7 d后,無菌刮除表層氣生菌絲,然后用滅菌的毛刷蘸無菌水涂刷在底層菌絲表面,置 25～28℃,12 h光照黑暗交替的環境中培養,促使其產生大量孢子供鏡檢鑒定和回接實驗用。菌種鑒定參考真菌鑒定手冊[1-4]。

1.3 回接和病原菌株的確定

利用健康無損的生長期果子,使用傷口接種和噴霧接種兩種方法,各菌株接 3～5個健康柑桔果子。傷口接種方法是先進行桔子表面消毒,用無菌水沖洗后,用接種針在桔子皮上扎一個直徑 0.15 mm的小孔,孔處接種孢子或菌絲片段的懸液后用塑料膜套上,保濕 3 d后去膜,在自然條件下發病。噴霧接種是將孢子或菌絲片段懸浮液直接噴于健康果子上,其他操作同傷口接種。接種后每 2 d觀察 1次,記載發病果數和癥狀,待充分發病后,取典型病果進行再分離。

2 結果和分析

2.1 自然發病桔林的典型癥狀

該病原致病性很強,病害從春季開始顯癥,首先侵害幼葉。幼果長出后侵害幼果,此后可侵害各階段果子和葉子,使葉子、果子大量脫落形成空枝。病害侵害葉子,初為黃色沿葉脈擴散形成不規則病斑,后使局部甚至大半個葉子枯死 (圖 1);病菌侵害果子,病斑初為黃色或橙色、邊緣不整齊、形狀不規則的小病斑,后擴大成圓形,黑紅色病斑中間凹陷,大小為 3～10 mm,病斑周圍有黃色暈圈為菌絲擴散 (圖 2)。病害不侵害果肉,但病果、葉子大量脫落。染過病的果子味苦難以食用。

圖1 葉子病斑形態

圖2 果皮典型病斑形態

2.2 菌株分離和初步鑒定結果

通過 33個典型病果的病斑組織分離獲得 45個分離物,依培養性狀和形態特征初步歸屬于 5個真菌分類單位 (見表 1)。5個菌株中,分離頻率最高的是細交鏈孢菌 (A lternaria tenuis),分離頻率為97.8%;莖點霉屬 1種 (Phom asp.)分離頻率為91.1%;刺盤孢屬 (Colletotrichumsp.)1株,分離頻率為 88.9%;一種在常規培養下未能誘導產孢的菌株的分離頻率為 73.3%,曲霉屬 1種 (Aspergillussp.)分離頻率為 26.7%;鐮刀菌屬 1種 (Fusicoccumsp.)分離頻率為 11.1%。

表1 柑桔褐斑病病理組織真菌分離頻率

2.3 病原菌株的確定

回接實驗結果表明,只有果 1-歌 1株可以誘導健康果子產生典型病斑,而且致病性非常強。傷口接種病原后保濕三天可見周圍邊緣染病褐變,7天后出現明顯的圓形褐斑,其癥狀表現和典型癥狀相似,并可從病斑處分離到此菌,可確定是該病的病原菌。鐮刀菌接種可使果子腐爛,但不表現典型病斑;其它菌株均無明顯病斑產生。噴霧接種發病遲于傷口接種。

2.4 病原菌的培養性狀、測微和鑒定

果 -歌在 PDA培養基上生長迅速,新生菌絲白色,沿培養基向四周擴展很快;后期菌絲變成灰綠色、鼠灰色,菌絲體茂密 (圖 3)。黑暗培養一周后,刮除氣生菌絲并用毛刷刷無菌水于基內菌絲表面,再行光照黑暗交替培養可產生大量分生孢子,全黑暗培養條件下長期培養不產孢。分生孢子器球形,黑褐色或黑色,單質或碳質,散生在培養基表層。分生孢子梗無。分生孢子器近乎球形,有 1孔口,壁革質至炭質,黑色。分生孢子器直徑 83.74～109.22μm,孔口直徑 19.3～34.1μm (圖 4)。分生孢子長圓形,兩端各有油球 1個,孢子大小為5.3～8.2μm ×1.6～2.3μm。根據以上特征,該病原分類地位為半知菌亞門刺盤孢 (Colletotrichumsp.)真菌[1-4],其種名有待進一步確定。

圖3 接種于 PDA平板培養 3d的菌落形態

圖4 產孢結構 (400×)

3 結論與討論

分離的菌株進行傷口和噴霧接種發病癥狀與典型癥狀進行比較,結果證明,導致此柑桔炭疽病大規模流行的病原菌為刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)真菌,為強致病性,其種名有待進一步確定。從分離頻率看,極細鏈隔孢菌(Alternaia tenuis)高于Colletotrichumsp.,但經過反復驗證,A.tenuis不導致塘房桔果子發病。但A.tenuis有如此高的分離頻率,可以認為A.tenuis是塘房桔果內一種內生菌。很多報道顯示A lternaiasp.為致蘋果、冬棗等黑斑病的病原菌[5-7],而A.tenuis卻不能使塘房桔發病,或許此桔子品種對A.tenuis有較強的抗病性。

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