山東臨沂地區漢族人群HLA-A、B、DRB1位點基因多態性研究

張智浩，宋永紅，張 毅，聶向民，莊云龍，朱傳福

(1.大連醫科大學 檢驗醫學院，遼寧 大連 116044； 2.山東省血液中心，山東 濟南 250014)

人類白細胞抗原(Human leukocyte Antigen,HLA)是迄今為止人類基因組中最復雜的遺傳多態性和免疫多態性基因體系，它位于6P21.3，其中的HLA-A、B、DRB1是基因多態性最高的3個HLA基因座。現已發現4000多個等位基因[1,2]，并具有顯著的人種、民族、地域差異[3]，也是人類遺傳學的一個重要遺傳標志。同時，在醫學和法醫學等多個領域均具有重要的研究意義和應用價值[4]。HLA的多態性取決于其基因的堿基序列，所以用分子生物學技術直接從基因水平對HLA基因多態性進行分析，方法準確，已在骨髓庫和臨床廣泛使用[5]。本研究應用聚合酶鏈反應-序列特異性寡核酸探針(PCR-SSOP)方法對山東臨沂地區造血干細胞志愿捐獻者進行HLA-A、B、DRB1基因分型，分析山東臨沂地區漢族人群HLA分布特點，報告如下。

1 材料和方法

1.1 分析對象

2009年1～12月山東臨沂地區健康、無血緣關系的漢族造血干細胞捐獻者4035人，抽取EDTA抗凝全血5 mL。

1.2 主要試劑和儀器

Qiagen DNA提取試劑盒，Onelambda 公司的LABType SSO試劑盒，GeneQuant Pro 核酸蛋白濃度測定儀(美國Amersham Biosciences)，ABI9700 擴增儀(美國ABI)，Genegenius凝膠成像儀(美國Gene公司)和luminex100 分析儀。

1.3 分型方法

(1)提取全血中的DNA，DNA濃度30～150 ng/μL A值260/280比值等于1.6～1.9。(2)擴增DNA，PCR擴增條件嚴格按照說明書操作。(3)電泳，取5～8 μL擴增產物，2%瓊脂糖凝膠電泳15 min，紫外成像儀觀察拍照。(4)采用PCR-SSOP流式磁珠分型方法，獲得HLA-A、B、DRB1的分型結果。

1.4 統計學方法

對4035例獻血者HLA-A、B、DRB1的分型結果，用直接計算方法計算其等位基因頻率。不同地區間的比較使用2×2表格法，χ2=(ad-bc)2*n/(a+b)(c+d)(a+c)(b+d)，其中n=a+b+c+d[6]，以P<0.005判斷基因頻率的差異是否具有統計學意義。

2 結 果

2.1 山東臨沂地區漢族人群HLA-A、B、DRB1位點等位基因頻率

本組共檢出18種HLA-A等位基因，32種HLA-B等位基因，13種HLA-DRB1等位基因。其中，HLA-A、B、DRB1位點等位基因頻率高于10%的分別是：A*02(27.3978%)、A*24(14.624%)、A*11(14.2131%)、A*30(11.5861%)、A*33(11.5613%)、B*13(15.8736%)、B*15(12.9864%)、B*40(11.5118%)、DRB1*15(18.3271%)、DRB1*07(15.3160%)、DRB1*04(10.7683%)。見表1。

2.2 山東臨沂地區漢族人群HLA-A、B、DRB1位點等位基因頻率分別與其它地區的漢族人群比較結果

選取山東臨沂地區漢族人群的HLA-A、B、DRB1位點等位基因頻率前8位分別與遼寧省漢族人群、山東省漢族人群、重慶市漢族人群以及海南省漢族人群進行比較。結果見表2。

山東臨沂地區漢族人群HLA-A位點等位基因頻率與遼寧地區漢族人群比較， A*33、A*30、A*11、A*24、A*02等位基因分布頻率有顯著性意義(P<0.005)；與山東地區漢族人群比較， A*30、A*33、A*02等位基因分布頻率有顯著性意義(P<0.005)；與重慶地區漢族人群比較中的A*11、A*30、A*33、A*03、A*01、A*31等位基因分布頻率差異有顯著性意義(P<0.005)；與海南地區漢族人群比較中A*02、A*24、A*11、A*30、A*33、A*03、A*01、A*31等位基因分布頻率差異有顯著性意義(P<0.005)。

山東臨沂地區漢族人群與遼寧地區漢族人群相比， HLA-B*13、B*15、B*40、B*44、B*07、B*46等位基因分布頻率差異有顯著性意義(P<0.005)；與山東地區漢族人群比較中的HLA-B*13、B*40、B*07等位基因分布頻率差異有顯著性意義(P<0.005)；與重慶地區漢族人群比較中的HLA-B*13、B*40、B*07、B*58、B*46等位基因分布頻率差異有顯著性意義(P<0.005)；與海南地區漢族人群比較中HLA-B*13、B*40、B*51、B*44、B*07、B*58、B*46等位基因分布頻率有顯著性意義(P<0.005)。

表1 山東臨沂地區漢族人群HLA-A、B、DRB1位點等位基因頻率Tab 1 Allele frequency of HLA-A、B、DRB1 locus in Shandong Linyi Han population

基因型實測等位基因數基因頻率(%)B?37730．9046B?381752．1685B?391361．6853B?4092911．5118B?41130．1611B?4240．0496B?445196．4312B?45150．1859B?464075．0434B?4750．0620B?482533．1351B?49200．2478B?50590．7311HLA-DRB1DRB1?012533．1351DRB1?033254．0273DRB1?0486910．7683DRB1?07123615．3160DRB1?084936．1090DRB1?097989．8885DRB1?10941．1648DRB1?114215．2169DRB1?127669．4919DRB1?136838．4634DRB1?144525．6010DRB1?15147918．3271DRB1?162012．4907

山東臨沂地區漢族人群HLA-DRB1位點等位基因頻率與遼寧地區漢族人群比較中的DRB1*07、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*13、DRB1*14等位基因分布頻率有顯著性意義(P<0.005)；與山東地區漢族人群比較中的 DRB1*15、DRB1*07、DRB1*04、DRB1*09、DRB1*13等位基因分布頻率有顯著性意義(P<0.005)；與重慶地區漢族人群比較中的DRB1*15、DRB1*07、DRB1*04、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*13、DRB1*14等位基因分布頻率有顯著性意義(P<0.005)；與海南地區漢族人群比較中DRB1*15、DRB1*07、DRB1*04、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*13、DRB1*14等位基因分布頻率有顯著性意義(P<0.005)。

3 討 論

人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因定位于6號染色體短臂上,長約3600 kb，是機體內特異性免疫識別和免疫應答的主要成分，在遺傳學、法醫學和移植免疫中起著非常重要的作用。序列特異性寡核苷酸探針聚合酶鏈反應 (PCR-Sequence Specific Oligonucleotide Probe，PCR-SSOP)分型技術是目前最常用、認可度最高的基因分型技術。與傳統方法相比較，PCR-SSOP法具有靈敏度高、特異性強、需樣品量少等優點，可用于其他技術不易分辨的等位基因的檢測及位點的鑒定。

通過對4035名山東臨沂地區漢族造血干細胞志愿捐獻者HLA-A、B、DRB1基因分型結果的調查研究，揭示了山東臨沂地區漢族人群HLA-A、B、DRB1基因多態性的特征。本次抽樣調查共檢出HLA-A位點等位基因18種，HLA-B位點等位基因32種，HLA-DRB1位點等位基因13種。其中，比較常見的分別為A*02、A*24、A*11、A*30、A*33、B*13、B*15、B*40、B*51、B*44、DRB1*15、DRB1*07、DRB1*04、DRB1*09、CRB1*12。A*36、A*83、B*82、B*83是全世界都非常罕見的等位基因，本次未測到[13]。中國漢族人群可分為南、北方兩大主要人群，其中北方人群HLA-A位點高頻率等位基因依次是：A*02、A*11、A*24、A*33和A*30；HLA-B位點是：B*13、B*15(62)、B*40(60)、B*51以及B*46；HLA-DRB1位點依次是：DRB1*15、DRB1*09、DRB1*04、DRB1*07、DRB1*12。中國南方人群HLA-A位點高頻率等位基因依次是：A*11、A*02、A*24、A*33以及A*30；HLA-B位點是：B*40(60)、B*46、B*13、B*58和B*15(75)；HLA-DRB1位點是：DRB1*09、DRB1*15、DRB1*12、DRB1*04以及DRB1*08[5],山東臨沂地區漢族人群總體體現了中國北方漢族的特點。

表2 山東臨沂地區漢族人群HLA-A、B、DRB1位點等位基因頻率分別與其他地區的漢族人群比較結果Tab 2 Comparision of HLA-A,B,DRB1 allele frequency between Shandong Linyi Han and other Han population

1)與山東臨沂地區漢族人群等位基因頻率比較，P<0.005

山東臨沂地區漢族人群與遼寧省漢族人群HLA位點等位基因分布頻率比較，HLA-A*33、A*30、A*02、B*13、B*07、B*40、DRB1*09、DRB1*07、DRB1*13等差異有顯著性意義；HLA-A*33、A*02、A*30、B*13、B*07、B*40、DRB1*15、DRB1*07、DRB1*09等與山東省漢族人群等位基因分布頻率差異有顯著性意義；與重慶地區漢族人群等位基因分布頻率比較：A*11、A*33、A*30、B*46、B*07、B*13、DRB1*14、DRB1*15、DRB1*07等位點差異有顯著性意義；A*30、A*11、A*01、B*44、B*46、B*07、DRB1*07、DRB1*13、DRB1*15等位點與海南省漢族人群的等位基因分布頻率特點有明顯不同。

山東臨沂地區漢族人群與其他地區漢族人群的比較，HLA等位基因頻率均出現了比較明顯的差異。但與北方的漢族人群還是基本相似，與南方的漢族人群有明顯的差異。與山東地區漢族人群亦有較大的差異。另外，在作者報道的6個新HLA等位基因中，源于臨沂地區的就有兩個，分別為HLA-B*4086和HLA-B*4096[14,15]，說明HLA等位基因的分布在省內也有地域性的差異。

至2010年5月已報道有4000多個等位基因并且仍在不斷發現新的基因[16,17]。而本研究從HLA-A、B、DRB1位點等位基因頻率的分布差異看出，可以在中國建立造血干細胞資料庫的重要性和必要性。建立適合本地區和本民族的造血干細胞資料庫，對了解HLA等位基因的多態性分布和基因頻率的研究以及對某些疾病的診斷有重要的意義，也會提高器官移植者相合的幾率。本研究也為山東臨沂地區漢族人群的HLA等位基因相關性研究提供了有意義的參考數據。

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