Duchenne型肌營養不良癥的干細胞治療

孫默萱，孫文長

(大連醫科大學 微生物學教研室，遼寧 大連 116044)

Duchenne型肌營養不良癥(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是中國最常見的X連鎖隱性遺傳肌病，發病率約3/10萬活男嬰，女性為致病基因的攜帶者，所生男孩50%發病。臨床特征主要為緩慢進行性加重的對稱性肌肉無力和萎縮，無感覺障礙。通常3～5歲隱性起病，大多數患者伴有心肌損害，約30%患兒有不同程度的智能障礙。患兒一般12歲起不能行走，需坐輪椅，晚期患者因呼吸肌萎縮，多數在20多歲因呼吸道感染，心力衰竭而死亡[1]。

DMD的基因位于染色體Xp21，該基因跨度2300 kb，是已發現的人類最大基因，cDNA長14 kb，編碼3685個氨基酸，組成427 kD的抗肌萎縮蛋白。該細胞骨架蛋白位于骨骼肌和心肌細胞的質膜面，具有細胞支架、抗牽拉、防止肌細胞膜在收縮活動時撕裂的功能。DMD患者因基因缺陷而使肌細胞內缺乏抗肌萎縮蛋白，造成肌細胞膜不穩定并導致肌細胞壞死和功能缺失[1]。

目前,沒有有效措施來防止DMD癥狀出現或阻止病情惡化。針對DMD主要采取對癥治療及支持療法，如增加營養，使用ATP及維生素E等。多年來，人們一直在努力探索，尋找根治的有效方法。

1 干細胞的概要

干細胞(stem cell)是通過細胞分裂可以自我更新、并能分化產生特定細胞的細胞。胚胎干細胞分化潛能較大，在一定條件下可分化為機體任何一種組織器官，而成體干細胞分化潛能較小，其存在于成熟個體各種組織器官中，通常只能分化為相應的組織細胞，如肌肉干細胞。不同類型的干細胞已被用于肌肉萎縮動物模型(mdx小鼠)中，以合成抗肌萎縮蛋白，修復部分病理組織[2,3]。

2 干細胞治療

2.1 肌肉衛星細胞

肌肉“衛星細胞”位于骨骼肌纖維基板下，緊鄰漿膜，其中的前體細胞參與肌肉的生長和修復。具有以下表面標記的(CD45-Sca-1-Mac-1-CXCR4+β1-integrin+，CSM4B)的骨骼肌前體細胞可以分化為肌肉細胞，而mdx小鼠的此種骨骼肌細胞前體數目減少。從衛星細胞池中純化了CSM4B骨骼肌細胞前體，植入抗肌萎縮蛋白缺如的mdx小鼠，這些細胞前體可以分化成肌纖維，使抗肌萎縮蛋白表達，降低了肌肉炎癥和纖維化，明顯提高了收縮功能。移植的骨骼肌細胞前體也進入衛星細胞區，更新了內源性干細胞池并加入隨后的損傷修復中。有一些衛星細胞不僅具有分化功能，同時能進行自我更新[4]，具有骨骼肌干細胞功能，因此骨骼肌能終身執行修復功能并且始終保持衛星細胞池穩定。此種干細胞對其他肌肉的損傷也有良好的治療前景。

在肌肉生長的不同時期，細胞表面標志物也各不相同。Pax基因是肌肉生長的關鍵性調節因子，Pax3和Pax7決定早期肌肉形成，Pax3的持續表達是生成骨骼肌細胞前體的關鍵步驟[5]，在轉錄因子Eya2、Six1和Dach2的協助下激活Myf5使其表達[6]。肌源性調節因子Myf5、Myf6、MyoD和肌細胞生長素等是一系列調節肌肉生成的基礎，Myf5、Myf6、MyoD對骨骼肌的發育尤其重要，三者均突變的胚胎完全沒有成肌細胞和骨骼肌纖維，對突變物種的進一步遺傳分析發現，在調控骨骼肌發育過程中，Myf5和Myf6是MyoD的上游調節因子[7]。研究證實，將衛星細胞在體外培養使其分化能力降低[8]，對疾病的治療不利。因此，在選擇并分離合適的骨骼肌干細胞時應選擇高分化潛能的Pax3/7++細胞。

2.2 成血管細胞

目前，實驗多采用小鼠為研究對象，但小鼠并不能展現出此種疾病的全部臨床特征。為了進一步向臨床應用，必須論證干細胞移植在大型肌肉萎縮動物模型中的有效性。GRMD(Golden retriever muscular dystrophy)狗嚴重缺乏抗肌萎縮蛋白，不僅影響肢體、呼吸肌和心肌功能，而且累及咽肌，使消化功能嚴重受損[9]。當與 C2C12小鼠的肌母細胞同時培養或轉染 MyoD時，狗的外源性野生型成血管細胞(mesoangioblast)分化形成了多核肌管。為了檢測干細胞治療或基因療法的有效性，在不同程度免疫抑制下，研究者將自身抗肌萎縮蛋白基因更正的成血管細胞和外源性野生型成血管細胞分別植入兩個GRMD狗試驗組，并設立對照組。實驗結果分析顯示，外源性野生型成血管細胞使得受試對象大量表達抗肌萎縮蛋白，肌纖維得以重建，肌肉收縮功能明顯增強，甚至能恢復正常的行走功能。而經過基因更正的成血管細胞輸回自體產生的治療效果相對較差[7]。在使用外源性野生型成血管細胞治療的實驗組中，66.7%受試對象表現出明顯的功能增強。實驗結果失敗的2只狗，其中1只死于突發的心臟病，另一只由于注射的外源性野生型成血管細胞的量過少。而功能增強的4只狗中，有2只直到實驗結束都始終保持著良好的運動功能，而另外2只在一段時間后便失去了行走功能。對于這種現象還不能給出明確的解釋，不同受試對象間存在的很大變異性，也許與在接受移植細胞后機體的免疫抑制程度不同有關。這些推斷直接關系到將來的臨床試驗，作者建議臨床患者使用的供體細胞應來源于HLA配型一致的捐贈者[7]。

2.3 干細胞與基因治療相結合

已有數據表明，表達CD133表面標志物的人類血液源性細胞前體，能分化形成肌纖維。提取表達CD133的人類肌營養不良血液源性和肌肉源性干細胞，采用外顯子跳躍技術糾正原有的基因缺陷，可以產生有功能的抗肌萎縮蛋白，是一種將基因治療與干細胞治療相結合的療法[10]。先分離DMD CD133+細胞并感染慢病毒載體，該載體攜帶用以剔除外顯子51的反義寡核苷酸，可在前體細胞中表達短一些但仍有功能的人類抗肌萎縮蛋白。有肌肉再生潛能的血液源性CD133+干細胞已在前面的工作中被證實，此次展示了肌肉源性CD133+干細胞也有向肌肉和內皮細胞分化的能力。剔除外顯子51可以糾正原始閱讀框架移位，在外顯子48和52之間表達正確的閱讀框。剔除后的血液源性和肌肉源性干細胞能在體內融入肌纖維，不僅表達功能性人類抗肌萎縮蛋白，而且質膜再表達α和β肌糖蛋白證實了抗肌萎縮蛋白相關的蛋白復合體得以重建，它們可以分化成為肌營養不良骨骼肌細胞內的衛星細胞。然而，在肌營養不良患者的肌肉內注射這些干細胞只能使周圍部分肌纖維得以再生，為了解決這個問題，研究者嘗試著在血管內注射干細胞。實驗結果顯示，大部分受損肌肉不僅在形態上得以糾正，功能也達到了正常水平。此種方法使用患者自身的干細胞，減少了移植的免疫排斥反應。外顯子跳躍技術不僅用于骨骼肌糾正原有的基因缺陷，同樣也成功地應用于糾正mdx小鼠的心肌基因缺陷，取得了良好的效果[11]。另有研究顯示，將含小型化抗肌萎縮蛋白的慢病毒導入新生mdx小鼠，蛋白表達可長達2年，受轉化的肌肉干細胞可參與肌肉的再生[12]。但將細胞療法與基因療法相結合，也帶來了其它問題，尤其是生物安全性問題，可長期表達的逆轉錄病毒在細胞染色體的整合干擾了機體對一些持家基因、癌基因或腫瘤抑制基因的控制，可能增加腫瘤形成的風險，對此需謹慎考慮。因此，人們又嘗試了電轉移抗肌萎縮蛋白質粒DNA至肌肉細胞，以避免逆轉錄病毒整合至宿主染色體的危險[13]。

2.4 誘導多能干細胞與人工染色體

干細胞治療中的一個難題是移植細胞的免疫排斥問題。最近，誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell)的出現，給這個問題的解決帶來了新的手段。將患者的成纖維細胞分離，導入Klf4,Sox2,Oct4,c-Myc 等因子，使之成為患者特異的誘導多能干細胞，再誘導分化成所需要的組織細胞，移植入患者體內，這樣可有效地避免移植物的免疫排斥問題[14-16]。研究人員已利用患者的成纖維細胞先導入含DMD基因組的人工染色體，糾正其基因缺欠，再將已糾正的成纖維細胞制備成誘導多能干細胞，最后分化成表達抗肌萎縮蛋白的肌肉干細胞[17]。從干細胞批量誘導形成肌肉細胞的方法也已經建立[18,19]。結果顯示，人工染色體表達穩定，相對于慢病毒，無插入突變的危險[20]，患者特異的誘導多能干細胞又可避免移植細胞的免疫排斥問題，因此，這種途徑在臨床上將有較好的應用前景。

3 展 望

具有自我更新、自我分化能力的干細胞在Duchenne型肌營養不良癥的動物實驗中取得了預期的良好結果。但考慮到從動物實驗到人體應用的復雜性及一系列體內環境因素的影響，在其成為臨床治療方案之前仍需要積極探索，不斷完善。干細胞療法與基因治療的結合有望在臨床治療中取得良好效果。

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