β-catenin和DKK-1在子宮內膜樣腺癌中的表達及意義

張麗潔，王莉芬，王艷華

(1.大連醫科大學 附屬第一醫院 婦產科，遼寧 大連 116011；2.大連醫科大學 附屬第二醫院 病理科，遼寧 大連 116023)

子宮內膜癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一。它是一種發生在子宮內膜上皮的惡性腫瘤，以子宮內膜樣腺癌最為常見，是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%[1]。近年來發病有逐步上升的趨勢。目前，子宮內膜癌的發病機制尚不十分清楚。因此,研究子宮內膜癌發生的分子途徑,尋找以分子為靶點的治療途徑成為焦點。研究發現，子宮內膜癌的發生與腫瘤細胞中某些信號傳導過程失控有關。近年來在研究子宮內膜周期性變化、子宮內膜增生和癌變的過程中，發現β-catenin[2-5]和DKK-1[6-8]與子宮內膜癌的發生發展相關，但是僅見少數報道，且結果不一致。因此，本實驗的目的是通過對β-catenin和DKK-1在子宮內膜樣腺癌、子宮內膜單純性增生和正常增生期子宮內膜中表達水平的檢測，探討它們在子宮內膜樣腺癌發生過程中的可能的作用和相關性，為從分子水平研究子宮內膜癌發病機制，探討預防、診斷、治療的新途徑。

1 材料和方法

1.1 材 料

隨機選取大連醫科大學附屬第二醫院病理科2003年1月～2009年3月病理確診為子宮內膜樣腺癌的組織蠟塊30例作為實驗組，患者年齡35～66歲，平均55歲。以2002年1月～2009年3月大連醫科大學附屬第二醫院因子宮肌瘤手術切除的17例正常增生期子宮內膜組織蠟塊(A組，年齡30～48歲，平均39歲，平素基本月經規律，組織學檢查未見異常)以及病理確診的單純性增生子宮內膜組織蠟塊20例(B組，患者年齡35～55歲，平均44歲)為對照組，實驗組的30例設為C組。各組均術前3個月內未用過激素類藥物和放化療，無其他婦科合并癥。

1.2 方 法

采用免疫組化MaxVisionTM法，操作步驟按試劑說明書進行：石蠟切片常規脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)高溫高壓抗原修復β-catenin和DKK-1， 0.3% H2O2室溫10 min，以滅活內源性過氧化物酶活性，羊血清封閉液室溫10 min，加一抗(β-catenin兔抗人多克隆抗體:克隆號：sc-7199,為美國Santa Cruz產品，1∶400稀釋。DKK-1鼠抗人單克隆抗體:H00022943-M08,購于臺灣abnova 公司，1∶250稀釋)，37℃水浴箱中80 min，滴加MaxVisionTM快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物，置于37℃水浴恒溫箱孵育20 min。DAB顯色、蘇木素復染、脫水、透明、封片。用PBS代替一抗作空白對照。

1.3 結果判斷

β-catenin及DKK-1陽性表達呈黃色或棕黃色顆粒，主要定位于細胞質及細胞膜。采用半定量積分法對染色結果進行判斷：隨機選取10個高倍視野進行細胞計數，陽性細胞數所占百分數：0%～5%計0分；6%～25%計1分；26%～50%計2分；51%～75%計3分；76%～100%計4分；染色強度：無染色計0分，淡黃色計1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。以陽性細胞數和染色強度兩種計分的乘積作為毎例標本的陽性表達強度。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 β-catenin和DKK-1蛋白的表達

β-catenin和DKK-1蛋白在正常增生期子宮內膜(A組)、子宮內膜單純性增生(B組)和子宮內膜樣腺癌(C組)中均有表達,主要位于腺上皮細胞和腺癌細胞，與增生期子宮內膜腺上皮相比,子宮內膜單純增生和子宮內膜樣腺癌的表達量均明顯降低(P<0.05)。見表1、圖1～6 。

表1 β-catenin和DKK-1在不同子宮內膜的表達情況Tab 1 Expression of β-catenin and DKK-1 in different endometrium

1)與A組比較，P<0.05；2)與A、B組比較，P<0.05

2.2 β-catenin和DKK-1在不同子宮內膜中的相關性分析

17例正常增生期子宮內膜(A組)、20例單純性增生子宮內膜(B組)中β-catenin和DKK-1兩種蛋白之間不存在相關性，P>0.05；30例子宮內膜樣腺癌(C組)中β-catenin與DKK-1的表達呈正相關，P<0.05。見表2。

圖1 正常增生期子宮內膜β-catenin的表達 ×100 MaxVisionTMFig 1 Expression of β-catenin in normal proliferative phase endometrium ×100 MaxVisionTM

圖2 單純性子宮內膜增生β-catenin的表達 ×100 MaxVisionTMFig 2 Expression of β-catenin in simple endometrial hyperplasia ×100 MaxVisionTM

圖3 子宮內膜樣腺癌β-catenin的表達 ×100 MaxVisionTMFig 3 Expression of β-catenin in endometrial adenocarcinoma ×100 MaxVisionTM

圖4 正常增生期子宮內膜DKK-1的表達 ×100 MaxVisionTMFig 4 Expression of DKK-1 in normal proliferative phase endometrium ×100 MaxVisionTM

圖5 單純性子宮內膜增生DKK-1的表達 ×100 MaxVisionTMFig 5 Expression of DKK-1 in simple endometrial hyperplasia ×100 MaxVisionTM

圖6 子宮內膜樣腺癌DKK-1的表達 ×100 MaxVisionTMFig 6 Expression of DKK-1 in endometrial adenocarcinoma ×100 MaxVisionTM

表2 β-catenin、DKK-1在不同子宮內膜中之間的相關性Tab 2 Relation of β-catenin and DKK-1 in different endometrium

3 討 論

β-連環蛋白(β-catenin)具有細胞間粘附連接和信號轉導雙重功能，是一種多功能細胞內蛋白。它參與Wnt信號通路，激活CyclinD1等癌基因，與腫瘤的發生發展有密切關系[5,9,10]，是Wnt通路中有調控轉錄活性的關鍵成員[11]。在正常情況，β-catenin與E-cadherin的胞內區形成復合體,并位于細胞膜上，參與維持上皮細胞的極性和完整性。在多種因素作用下Wnt信號異常激活，或β-catenin發生突變，細胞中β-catenin的磷酸化和降解不能正常進行，游離的非磷酸化β-catenin在胞漿內大量積聚后進入核內，激活相應靶基因(如CyclinD1等)，引起細胞增殖和分化失控，最終導致腫瘤的發生和發展。周留林等[12]發現，子宮內膜樣腺癌β-catenin在細胞膜上的陽性表達率明顯低于子宮內膜增生癥及正常子宮內膜,而在細胞核上的陽性表達率增加，在細胞質中表達均為陰性。吳時敏[5]報道子宮內膜樣腺癌β-catenin陽性表達率明顯高于正常子宮內膜，陽性表達定位于胞質/胞核。本研究發現，子宮內膜樣腺癌中陽性表達率明顯低于單純性子宮內膜及正常增生期子宮內膜，陽性表達定位于胞質/細胞膜。本研究未檢測到β-catenin在細胞核內的表達，可能與抗體的來源、批號及克隆號不同有關。本研究中子宮內膜樣腺癌細胞質/細胞膜中β-catenin陽性表達率降低，可能是由于細胞質中積累的β-catenin進入核內增多，導致胞質內β-catenin表達降低；也可能由于β-catenin基因突變,產生具有致癌作用的突變型蛋白,而目前尚無檢測突變型β-catenin的抗體。總之，子宮內膜樣腺癌發病機制復雜，可能受多基因、多通路調節的影響，β-catenin只是Wnt通路中的一員。Lowy等[13]檢測胰腺癌細胞癌組織中β-catenin的表達，發現56%的胰腺癌β-catenin膜表達減少。因此，β-catenin在子宮內膜癌的發生發展中所起的作用有待進一步研究。

DKK-1是一種分泌蛋白，是Wnt通路強有力的抑制劑,其通過Wnt信號轉導途徑，調控細胞的分化、增殖、極性、遷移和癌變[6,7]。Qiao[14]報道，由于間充質細胞分泌的DKK-1,通過抑制Wnt信號通路，從而抑制乳腺癌的生長；DKK-1在Wnt信號轉導通路中是一種陰性調節劑，它能抑制Wnt通路的活動[8]。Yi N等[15]指出DKK-1在子宮內膜癌中的表達水平明顯地低于在良性子宮內膜中表達水平,外源性DKK可抑制子宮內膜癌的侵襲。DKK-1參與了子宮內膜癌的發生和抑制其早期子宮內膜癌侵襲,并有望作為一種生物標志來篩選子宮內膜癌的進展。Kuang[16]報道用DKK-1轉染的HEK293細胞能明顯地降低β-連環蛋白(β-catenin)和E-粘連素(E-cadherin)在細胞膜上積聚，DKK-1刺激β-連環蛋白從細胞膜上的釋放并使細胞易于轉移。Zhu[17]的研究報道，人間充質干細胞通過分泌DKK-1，抑制癌細胞的增殖。當DKK-1被DKK-1抗體中和或DKK-1表達被RNA干擾下調時，間充質干細胞對K562細胞的增殖的抑制效應下降。本研究發現，DKK-1在子宮內膜樣腺癌的表達明顯低于正常增生期子宮內膜及單純性增生子宮內膜。提示DKK-1表達降低，對Wnt信號通路的抑制作用減弱，使細胞增生活躍和異常增生，導致子宮內膜腺癌的發生。

本研究對β-catenin、DKK-1在子宮內膜樣腺癌中的表達做了相關性分析。結果顯示，子宮內膜樣腺癌中β-catenin在胞膜/胞質中的表達與DKK-1的表達呈正相關。提示子宮內膜樣腺癌發生發展在一定程度上是由于β-catenin在胞膜/胞質中的異常表達所致,β-catenin在胞膜/胞質中的表達與DKK-1的表達起一定的協同作用。而17例正常增生期子宮內膜和20例單純性增生子宮內膜中β-catenin和DKK-1兩種蛋白之間不存在相關性。這有可能與病例數較少有關，也可能與試劑及Wnt通路復雜有關。近年來，雖然在Wnt通路研究中，取得了較大進展，但在腫瘤發生發展中的作用仍有待進一步深入的研究。

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