多重PCR-CE用于血小板抗原HPA-2、-3、-15基因分型的研究

劉 銘，周世航

(1.大連醫科大學 細胞生物學教研室，遼寧 大連 116044； 2.大連市血液中心，遼寧 大連 116001)

血小板特異性抗原(human platelet antigens，HPA)又稱血小板抗原，是位于血小板膜上的糖蛋白。目前，通過血清學方法已確認了24個HPA，其中的12個被分成6個HPA系統(HPA-1～5、15)。迄今，24個HPA中的22個HPA的分子基礎已經得到了闡明。除了HPA-14bw外，其它均由于單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)導致的單個氨基酸改變而產生的[1]。臨床上，在血小板輸注或懷孕過程中，如果血小板同種抗原不合，可導致機體產生血小板同種抗體，引起同種免疫血小板減少綜合征，如新生兒同種免疫血小板減少性紫癜、輸血后紫癜、血小板輸注無效等[2]。此外，HPA的基因頻率在不同種族人群中的分布有一定的差異[3,4]。因此，對HPA進行快速而準確的分型在臨床和輸血醫學以及遺傳學和人類學研究中均有著十分重要的意義。

隨著對HPA的分子生物學特征的進一步認識以及分子生物學技術的發展，許多分子生物學方法，開始應用于HPA的基因分型。本研究聯合應用多重PCR和高分辨率的毛細管電泳技術(CE)建立了一個用于HPA -2、-3、-15系統基因分型的多重PCR-CE方法，并調查了大連地區獻血人群中HPA -2、-3、-15系統的基因型和基因頻率。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

隨機選取大連市血液中心的100名獻血者，均為漢族無血緣關系個體。每例采集血樣2 mL于-20℃保存。

1.2 主要試劑和儀器

PCR試劑盒、去離子甲酰胺、GeneScan500[ROX]購自美國Applied Biosystem公司；血液DNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司； DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；TP-600型PCR擴增儀 購自寶生物工程(大連)有限公司； ABI PRISM 310 Genetic Analyzer 購自美國Applied Biosystem公司。

1.3 血樣DNA提取

使用DNA提取試劑盒(鹽析法)，提取血樣DNA。

1.4 引物合成

引物由寶生物工程(大連)有限公司合成并進行熒光標記。多重PCR引物序列見表1。

表1 多重PCR引物Tab 1 Primers for multiplex PCR

1.5 PCR-SSP

PCR反應體系為20 μL，包括100 ng DNA、0.4 μmol/L HPA分型引物、0.2 μmol/L內對照引物、500 mmol/L KCl、100 mmol/L Tris-HCl(PH8.3)、1.5 mmol/L MgCl2、200 mmol/L dNTP、1 U AmpliTaq Gold DNA Polymerase。 PCR反應條件： 預變性，95℃,10 min；然后，變性，95℃,30 s，退火，60℃,30 s， 延伸，72℃,90 s，共30個循環；最后一次延伸 72℃,5 min[4]。

1.6 多重PCR

PCR反應體系為20 μL，包括100 ng DNA、0.4～1.0 μmol/L HPA分型引物、500 mmol/L KCl、100 mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、1.5 mmol/L MgCl2、200 mmol/L dNTP、1 U AmpliTaq Gold DNA Polymerase。PCR反應條件：預變性，95℃,10 min；然后，變性，95℃,30 s退火，60℃,30 s， 延伸，72℃,90 s，共30個循環 ；最后一次延伸 72℃,5 min。

1.7 毛細管電泳

取1 μL PCR產物(1∶10稀釋)與24 μL去離子甲酰胺和1 μL GeneScan500[ROX]混合，95℃變性5 min，然后立即冰浴3 min，轉至樣品管中，在ABI PRISM 310 Genetic Analyzer上進行毛細管電泳。電泳凝膠為POP4 polymer,毛細管47 cm(長)×50 μm(內徑)。所用內標準為GeneScan 500 [ROX]，該條件下可檢測峰片段長度分別為：75、100、140、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500 bp。PCR產物為藍色峰，而內標準顯示為紅色峰。

1.8 統計學方法

使用直接計數法計算基因頻率。 采用χ2檢驗進行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗以及不同地區的人群基因頻率比較。統計分析軟件為SPSS 11.5，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 多重PCR-CE基因分型

100名獻血者HPA -2、-3、-15系統的多重PCR-CE基因分型結果見表2。結果符合Hardy-Weinberg平衡。圖1是1例樣本的多重PCR-CE基因分型圖譜。

表2 大連地區100名獻血者的HPA -2、-3、-15系統的基因分型Tab 2 Genotyping of HPA-2,-3 and -15 in 100 Dalian donors

圖1 1例樣本的多重PCR-CE基因分型Fig 1 Genotyping of one sample using multiplex PCR-CE1:HPA-15b; 2:HPA-15a; 3:HPA-3b;4:HPA-3a;5:HPA-2b;6:HPA-2a;樣本的基因型:HPA-2ab、HPA-3ab、HPA-15ab

2.2 多重PCR-CE與PCR-SSP的比較

為了驗證多重PCR-CE的準確性，同時也使用常規的PCR-SSP方法，對100名獻血者的樣本進行HPA -2、-3、-15系統基因分型。結果表明，這兩個方法的基因分型結果是完全一致的。圖2是1例樣本的PCR-SSP基因分型圖譜。

圖2 1例樣本的PCR-SSP基因分型Fig 2 Genotyping of one sample using PCR-SSP樣本的基因型:HPA-2aa、HPA-3aa、HPA-15ab

2.3 大連地區漢族人群HPA -2、-3、-15系統等位基因頻率與國內部分地區人群比較

大連地區漢族人群與國內山東、上海、浙江漢族人群相比，HPA -2、-3、-15系統等位基因頻率差異無顯著性意義(P>0.05)；與新疆維吾爾族相比，HPA -2、-3系統等位基因頻率差異無顯著性意義(P>0.05)，而HPA-15系統等位基因頻率差異有顯著性意義(P<0.05)。見表3。

3 討 論

在HPA各個系統中，從本質來說，除了HPA-14bw外，HPA均是由SNP引起的。因此，用于SNP分型的各種方法也適用于HPA的基因分型。目前，用于HPA系統基因分型的方法眾多，包括聚合酶鏈反應-序列特異性引物(PCR-SSP)[3,4]、聚合酶鏈反應-限制性內切酶片段長度多態性(PCR-RFLP)[9]、聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析(PCR-SSCP)[10]、熔解曲線分析法[11,12]、TaqMan探針實時PCR[13]、置換探針多色實時PCR[14]以及基因芯片[15]等方法。以上方法中，PCR-SSP是目前應用最廣泛的HPA基因分型方法。雖然PCR-SSP應用較廣，但是該方法對于每個HPA系統的一對等位基因，需要進行兩個PCR反應，才能完成基因分型。

為了克服PCR-SSP檢測通量低的缺點，本研究聯合使用了多重PCR和毛細管電泳技術。首先，對常規PCR-SSP方法進行了改進。利用引物的5’端的序列不影響PCR擴增的特點，在部分引物的5’端加上5個堿基，再將HPA -2、-3、-15系統的分型引物，置于一個PCR反應體系中，進行多重PCR。HPA -2、-3、-15系統的6個等位基因，經多重PCR后,將產生片段長度不同的等位基因擴增產物。然后使用高分辨率的毛細管電泳技術進行基因片段長度掃描，根據產物片段長度的大小而進行血小板抗原基因分型。為了驗證方法的準確性，同時使用建立的多重PCR-CE和常規的PCR-SSP方法對100名獻血者進行HPA -2、-3、-15的基因分型。結果表明，二者的分型結果是完全一致的。

表3 大連地區漢族人群HPA -2、-3、-15系統等位基因頻率與國內部分地區人群比較Tab 3 Comparison of gene frequencies of HPA-2,-3 and -15 in Dalian Han populations with that in other Chinese populations

1)與大連漢族相比，P<0.05

本研究建立的多重PCR-CE方法，可以同時檢測HPA系統的6個等位基因，檢測通量要遠遠高于常規的PCR-SSP法。而且，進行PCR產物檢測時，使用了自動化的毛細管電泳技術，既避免了瓊脂糖凝膠電泳的手工操作,也防止了DNA染色劑溴化乙錠對人體的危害。

本研究建立的多重PCR-CE方法只是對其中的HPA-2、-3、-15系統進行基因分型。Feng等[3]的研究表明，在中國漢族隨機輸血人群中，HPA-15、-3、-2的不配合幾率分別為37.40%、36.59%、8.80%，要遠高于其他HPA系統。因此，本研究建立的針對以上3個HPA系統的基因分型方法將有著極大的實際應用價值。

HPA等位基因頻率調查在群體遺傳學和臨床輸血等方面，都有著十分重要的價值。國內外一些研究表明，HPA等位基因頻率有一定種族分布特征[3,4]。本研究調查了大連地區漢族人群HPA -2、-3、-15的基因頻率，并與國內部分地區人群進行比較，結果表明大連地區漢族人群HPA-2、-3、-15的基因頻率和國內其他地區漢族人群沒有差異。國內的研究也證實，中國北方和南方漢族人群HPA-1～16的基因總體分布差異無顯著性意義[3]。但本研究也發現，大連地區漢族人群HPA-15的基因頻率和新疆維爾族人群有一定差異，這提示在國內HPA-15等位基因分布存在著種族差異。

總之，本研究中建立了一個優于PCR-SSP的簡單、快速、準確、高通量的HPA -2、-3、-15基因分型方法，闡明了大連地區漢族人群HPA -2、-3、-15的基因分布特征。這對于保障血小板的輸注安全,提高血小板輸注療效,研究HPA與疾病的關系，建立已知HPA基因型血小板供者庫等醫學領域以及群體遺傳學和人類學研究等方面均有著重要的意義。

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