苯甲基磺酰氟對三鄰甲苯磷酸酯暴露母雞腦組織基因表達譜的影響

王祥虎，樸豐源

(大連醫科大學 勞動衛生與環境衛生學教研室，遼寧 大連 116044)

一些有機磷化合物(OPs)可誘發遲發性神經毒性(OPIDN)。其病理特點是中樞神經及周圍神經軸突變性及脫髓鞘，以周圍神經長軸突損害為主。對OPIDN的發病機制，有不少假說，其中主要集中在Johnson[1]提出的“神經毒性酯酶學說”和Abou-Donia等[2]提出的“鈣穩態失衡學說”上，另有學者認為OPIDN是由T細胞介導的遲發變態反應。由于這些OPs既具有急性毒性又有OPIDN，使得在OP暴露早期階段，很難把由急性毒性和OPIDN作用各自引起的一些分子毒理學變化加以區分，給OPIDN本身的深入研究帶來了困難，OPIDN的發病機制到目前仍不清楚。

苯甲基磺酰氟(PMSF)是一種非有機磷化合物，在OPs暴露前給予時可防止誘發OPIDN，但對OPs的急性毒性不產生影響[3,4]。三鄰甲苯磷酸酯 (tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP)，屬有機磷類化合物，常作為經典的OPIDN誘發劑。本實驗根據PMSF這一特點，以雞為實驗對象，通過觀察PMSF干預對TOCP暴露雞大腦組織基因表達譜的影響，篩選與OPIDN相關的差異表達基因，為進一步研究OPIDN的發病機制提供靶基因信息譜。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和設備

TOCP (化學純度>96%)、PMSF(苯甲基磺酰氟)、TRIzol試劑盒(Invitrogen公司)；RNeasy Mini試劑盒(OIAGEN公司)；DEPC-Water(Ambion公司)； Gene ArrayTM掃描儀3000 (Affymetrix公司)、基因芯片雜交箱640(Affymetrix公司)、Microarray Suite Version 5.0分析軟件(Affymetrix公司)。其他試劑均為分析純試劑。

1.2 實驗動物處理

羅曼鶴母雞12只，10月齡，體重1.5～2.0 kg，由大連市韓偉養雞場提供。適應性飼養1周后隨機分為3組，即對照組、TOCP組和PMSF前干預組，每組4只。所有實驗雞均在給藥前15 min給予阿托品(10 mg/kg,皮下注射)以防止急性膽堿能中毒。TOCP組一次性灌胃給予TOCP (1000 mg/kg)， PMSF前干預組先皮下注射PMSF (40 mg/kg)，再一次性灌胃給予TOCP (1000 mg/kg)，對照組一次性灌胃給予生理鹽水(1000 mg/kg)。給藥后每天檢查實驗雞的變化及運動功能，第5天將動物麻醉放血處死，并立即取腦組織儲存于RNA later儲存液中，-80℃冰箱保存備用。

1.3 基因芯片

1.3.1 總RNA的提取：將樣品按不同處理方式(對照、TOCP和PMSF前干預組)分成3個樣品，分別在液氮中進行研磨至粉末狀，待液氮揮發干，按照TRIzol試劑盒的操作說明從腦組織中提取總RNA。

1.3.2 定量和檢測總RNA：用紫外分光光度計檢測 RNA的產量，在260 nm處的吸光度(A)，1 A=40 μg/mL。根據在 260 nm和280 nm處的吸光值，檢測RNA的純度，純RNA的A260/A280比值應接近2.0 (比值最好在 1.9～2.1 之間)。再用變性膠電泳質檢測RNA是否有降解。

1.3.3 純化總RNA：將總 RNA的體積用 RNase-free 的水調整到 100 μL，加入 350 μL RLT工作液充分混勻。加入 250 μL無水乙醇，充分混勻(不要離心)。將混好的 700 μL樣品加到 QIAGEN純化柱中，>8000 r/min，離心 15 s。棄濾液，加入 500 μL RPE工作液(1份 RPE 加入4 份無水乙醇混勻而成)，>8000 r/min，離心 2 min。將純化柱放入1個新的收集管，12000 r/min，離心 1 min。將純化柱換入1個 EP 管中，在純化柱膜中間加 25 μL RNase-free 的水，室溫放置 1 min，12000 r/min，離心 1 min。將 EP管中的樣品移入1個新的 EP管中。

1.3.4 基因芯片雜交：將提取的RNA反轉錄成cDNA。用RNA轉錄標記試劑盒進行體外轉錄合成cRNA探針，合成的同時進行生物素標記；生物素標記的cRNA探針經片段化處理后與Chick Genome 430 2.0 Araay基因芯片在雜交箱640中45%雜交16 h，然后于全自動芯片洗滌工作站450中洗脫、染色；最后用Gene Array TM掃描儀3000掃描雜交信號。

1.4 基因芯片數據處理和生物學信息分析

雜交結果用 Microarray Suite Version 5．0軟件進行分析。在對單個樣本表達分析的前提下，根據P<0.04為表達，0.04～0.06為臨界，P>0.06為不表達，分別建立對照組、TOCP組和PMSF前干預組大腦皮質全基因表達譜；然后將基因表達譜進行兩兩比較，表達差異倍數 >2為表達上調，表達差異倍數<-2為表達下調，篩選得到基因探針號輸入NetAffy網站 (www．affmetrix.con)中進行批量處理查詢(Batch Query)，查詢出對應的基因和生物學信息。

2 結 果

2.1 TOCP暴露雞腦組織中差異表達基因

TOCP暴露雞腦組織中的差異表達基因數量見圖1。與對照組比較，TOCP組雞腦組織中共有462個基因差異表達有顯著性意義，其中上調基因261個和下調基因201個。

圖1 TOCP暴露雞腦組織差異表達基因結果Fig 1 Result of the differentially expressed genes in the brain tissue of TOCP-treated hensA組：與對照組比較,TOCP暴露組雞腦組織中表達差異有顯著性意義的基因總數; B組：與對照組比較,TOCP暴露組雞腦組織中表達有顯著上調的基因數; C組：與對照組比較,TOCP暴露組雞腦組織中表達有顯著下調的基因數

2.2 TOCP暴露雞腦組織中OPIDN相關差異表達基因

如圖2所示，從 TOCP組雞腦組織中共篩選出與對照組比較表達差異有顯著性意義而與PMSF前干預組比較差異無顯著性意義的基因311個，其中包括上調基因171個和下調基因140個。

圖2 TOCP暴露雞腦組織OPIDN相關差異表達基因結果Fig 2 Result of the differentially expressed genes related OPIDN in the brain tissue of TOCP-treated hensA組：TOCP組中與對照組比較表達差異顯著而與PMSF前干預組比較差異無顯著性意義基因總數; B組：TOCP組中與對照組比較表達顯著上調而與PMSF前干預組比較差異無顯著性意義基因數；C組：TOCP組中與對照組比較表達顯著下調而與PMSF前干預組比較差異無顯著性意義基因數

對TOCP組雞腦組織中與對照組比較差異表達3倍以上，且在PMSF前干預組無差異表達的基因，作為OPIDN密切相關基因，共篩選36個。其中與對照組比較表達上調的基因有17個(表1)，主要包括離子跨膜轉運、細胞骨架、神經信號轉導等相關功能蛋白基因。與對照組比較表達下調的基因有19個(表2)，主要包括細胞凋亡、Ca2+轉運、細胞骨架、細胞代謝等相關功能蛋白基因。

表1 OPIDN密切相關上調基因Tab 1 The up-regulated genes closely related to OPIDN

3 討 論

一些OPs同時具有急性毒性和OPIDN[6-8]，使得在OPs暴露早期階段，很難把由急性毒性和OPIDN各自誘發所引起的一些基因或蛋白的差異表達變化加以鑒別，給OPIDN本身的深入研究帶來了困難。而PMSF在OPs暴露前給予時，可防止OPs誘發OPIDN，但對OPs的急性毒性不具有拮抗作用[3,4]。利用PMSF這一特點，通過PMSF干預可從OPs暴露動物模型的神經組織中篩選OPIDN相關差異表達基因線索。

表2 OPIDN密切相關下調基因Tab 2 The down-regulated genes closely related to OPIDN

本研究結果顯示，在TOCP暴露組雞腦組織基因表達譜38535個轉錄本中，共篩出與對照組比較有顯著差異表達的基因462個，可能與急性毒性或OPIDN或兩者相關。在這些基因中，與對照組比較表達差異有顯著性意義且與PMSF前干預組差異無顯著性意義的匹配基因有311個，可能與誘發OPIDN有關。尤其與對照組比較差異表達3倍以上，且在PMSF前干預組無差異表達的基因，共篩選36個，可能與誘發OPIDN密切相關。其中上調基因17個和下調基因19個，主要包括離子跨膜轉運、細胞骨架、神經信號轉導、細胞凋亡、Ca2+轉運、細胞代謝等相關功能蛋白基因。這些基因中一些基因的功能蛋白已引起部分學者的關注。文獻報道，TOCP暴露組雞腦組織微管相關蛋白2(MAP2)含量顯著增高，認為這種改變可能與遲發性神經毒性誘發有關[4,5]。王英鵬等[9]發現，在雞OPIDN 發病過程中出現腰髓前角神經元細胞凋亡現象，認為細胞凋亡可能在OPIDN 發病機制中起重要作用。從本研究基因芯片結果中發現，與上述文獻結果相關聯的基因都出現明顯的差異表達，進一步從基因水平證實了上述文獻的結果。

通過PMSF干預，從TOCP暴露雞腦組織中篩選出可能與OPIDN誘發相關的基因信息譜，今后應對這些基因進一步從蛋白水平加以驗證，并深入探索與OPIDN誘發之間的關聯性。

[1] Johnson MK.The delayed neurotoxic effect of some organophosphorous compounds.Identification of the phosphorylation site as an esterase [J].Biochem J,1969,114(4):711-717.

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