谷氨酸信號通路對黑素細胞樹突形態的調節作用

李麗麗，單路娟，張 媛，高船舟，劉越堅，宋智琦

(1.大連醫科大學 附屬第一醫院 皮膚科，遼寧 大連 116011；2.大連醫科大學 附屬第一醫院 中心實驗室，遼寧 大連 116011；3.遼寧師范大學生命科學學院 生物技術與分子藥物研發重點實驗室，遼寧 大連 116021；4.大連醫科大學 中心實驗室，遼寧 大連 116044)

谷氨酸是中樞神經系統中一種最重要的興奮性神經遞質。谷氨酸受體(glutamate receptors，GluRs)分為兩大類，一類是離子型谷氨酸受體(iontropic glutamate receptors，iGluRs)，該類受體屬于配體門控離子通道，通道的啟閉受谷氨酸調控。其中甲基-D-天冬氨酸受體2A(N-methyl-D-aspartate receptors 2A,NMDAR2A)是具有強烈的電壓依賴性和高Ca2+滲透性的一種亞型。另一類是代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors，mGluRs),該類受體是一類G蛋白偶聯受體，其中mGluR1可激活肌糖磷酸鹽代謝和細胞內鈣的轉運[1，2]。除了中樞神經系統外，非神經系統骨骼、睪丸、胰腺、肺臟、心臟以及皮膚組織等多種組織中已發現存在谷氨酸信號系統[3-6]。2009年有研究發現，表皮角質形成細胞(kerytinocytes,KCs)可分泌L-谷氨酸[7]；并且KCs具有谷氨酸受體NMDAR的表達，谷氨酸信號通路可能通過影響其細胞內鈣離子濃度而影響KCs的增殖和分化[8，9]?，F已證實表皮內的黑素細胞(melanocytes,MCs)內亦有NMDAR,α-氨基羥甲基異噁唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate receptor,AMPAR)等多種谷氨酸受體表達；并發現離子型谷氨酸受體AMPA抑制劑可下調MCs內MITF基因(Microphthalmia- associated transcription factor)的表達[10]，而后者為與MCs功能密切相關的重要調控基因之一。為進一步探討該信號通路在MCs中的作用，本研究進行了原代MCs內的離子型谷氨酸受體的蛋白表達檢測，同時觀察了干擾該信號通路下MCs樹突形態的變化。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

IMDM培養基，胎牛血清及胰酶(Gibico公司)，小鼠抗NMDAR2A單克隆抗體(Chemicon公司)，小鼠抗a-tubulin單克隆抗體(Gibico)公司，FITC標記山羊抗小鼠二抗(Gibico公司)，MK-801(Invitrogne公司)，Human Melanocyte Growth Supplem(HMGS)(Invitrogne公司)，Medium245(Invitrogne公司)，DispaseⅡ(Invitrogne公司)，N-Methyl-D-aspartic acid(NMDA)(Alexis Blomol公司)，Quisqualate(Q-LA)(Alexis Blomol公司)，Quanta 200F(型)掃描電鏡(美國FEI公司)。

1.2 原代MCs培養

1.2.1 分離培養：包皮為12～20歲泌尿外科包皮手術患者捐贈。包皮用碘伏浸泡消毒10 min，PBS洗滌3次，去除皮下組織，將包皮剪成1 mm×3 mm的皮塊，用0.5%Dispase中性酶Ⅱ4℃消化16 h，分離表、真皮。用眼科剪將表皮剪成2 mm×2 mm的皮片，37°C下用0.25%胰酶消化表皮10 min，200目篩網過濾，PBS洗滌2次，離心獲取較純凈表皮MCs，MCs用加human melanocyte growth supplem(HMGS)的Medium245培養基稀釋，以4×105個/mL的細胞密度接種到25 cm2的培養瓶中，于5%CO2，37℃條件下傳代培養，第3代細胞備用。

1.2.2 MCs鑒定：(1)多巴染色:取對數生長的MCs(2～3代)，0.25%胰酶消化,調節細胞密度為5×105/mL接種于含有蓋玻片的培養皿中,連續培養48～72 h,觀察細胞在蓋玻片上的生長情況。當達到60%～70%時,終止生長,4%多聚甲醛固定10 min,L-Dopa緩沖液孵育4～5 h,溫度37℃,鏡下觀察發現染液變為棕色即可終止。乙醇脫水、二甲苯透明、封片、陽性反應者細胞漿和樹突呈褐色至黑色。(2)透射電鏡觀察MCs超微結構:收集細胞，2.5%戊二醛固定后，經脫水、滲透、包埋、超薄切片、鈾鉛染色等常規電鏡樣品制備程序，于日立H-7000型透射電鏡觀察細胞中的黑素小體及分期。

1.3 Western Blot方法測定人類原代MCs內NMDAR2A的表達

收集MCs，用PBS緩沖液漂洗3次，離心，棄上清；視細胞密度酌情加入100～200 μL細胞裂解液RIPA，反復吹洗50次，冰上作用30 min；振蕩混勻，4℃下14000 r/min離心15 min；取上清液，100℃水浴中變性3～5 min，-20℃保存。而后采用考馬思亮藍法進行蛋白質定量分析。進行SDS-PAGE蛋白電泳和Western blot檢測：細胞溶解液蛋白(25 μg)在4%積層膠和7.5%分離膠的SDS-PAGE上電泳；濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜，將膜浸入5%脫脂奶粉1 h封閉非特異性抗原，膜與一抗稀釋液鼠抗NMDAR2A(1∶1000)及鼠抗α-tubulin(1∶1000)4℃下孵育過夜；第二天TBST洗3次，15 min/次，分別加入二抗HRP標記的抗鼠IgG(1∶5000)室溫孵育1 h，TBST洗3次，15 min/次，用ECL顯色系統曝光顯影。根據條帶的輝度判斷目的蛋白表達差異。上述試驗重復3次。

1.4 掃描電鏡下觀察MCs樹突形態

取第3代MCs于6孔板蓋坡片上培養24 h，細胞密度30%左右，加入谷氨酸受體激動劑(NMDA,Q-LA)和抑制劑(MK801)，48 h后，加入2.5%戊二醛固定后，常規掃描電鏡細胞樣品制作后，于美國FEI公司Quanta 200F型掃描電鏡觀察。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 MCs的鑒定

為鑒定原代培養細胞，分別采用多巴染色及透射電鏡觀察。結果如下：多巴染色顯示胞漿內呈黑褐色(圖1A、B)；掃描電鏡下可見細胞漿內大量的成熟的黑素小體(圖1C、D)。

2.2 Western Blot測定MCs內NMDAR2A的表達結果

Western Blot結果顯示，黑素細胞內有NMDAR2A蛋白的表達(圖2)。

圖1 黑素細胞生物學特性鑒定Fig 1 The identification of biological characteristics of melanocytesA,B：DOPA reactivity of melanocytes.Cells were cultured in medium supplemented with 5 mol/L DOPA under light microscopy(A×200,B×400)；C：Transmission electron micrographs of melanocytes(Scale bars = 2 μm)；D：The Stage III-IV melanosomes seen in cytoplasm of melanocytes(bar=500 μm)

圖2 NMDAR2A在黑素細胞內的表達Fig 2 The expression of ionotropic glutamate receptorNMDAR2A in human melanocytes Western blot was performed with 50 μg of protein lysates of normal melanocyte cells,Mouse brain lysate was loaded as a positive control(lane Ⅰ).170 kD product for NMDAR2A(lane Ⅱ)

2.3 掃描電鏡下觀察非競爭性NMDAR拮抗劑MK801及NMDAR激動劑N甲基D天門冬氨酸(NmethylDaspartate，NMDA)、AMPAR激動劑使君子酸(Quisqualate，Q-LA)作用下MCs細胞樹突的變化

MCs在NMDAR激動劑NMDA(200 μmol/L)和Q-LA(50 μmol/L)、非競爭性NMDAR拮抗劑MK801(150 μmol/L)分別作用48 h后細胞的樹突形態發生變化。NMDA及Q-LA作用后細胞樹突變粗，末端二、三級樹突增加。MK801作用后細胞樹突末端明顯變窄，二、三級樹突減少(圖3 A)。采用JEOL Smile View 2.1軟件測量細胞樹突長度(圖3B、C)，與陰性對照組比較，NMDA(200 μmol/L)和Q-LA(50 μmol/L)作用下樹突較短，P<0.05；非競爭性NMDAR拮抗劑MK801(150 μmol/L)作用下樹突長度無明顯變化。

圖3 NMDAR拮抗劑對黑素細胞樹突形態的影響Fig 3 The dendritic morphology changes of melanocyte treated by agonists or antagonist of NMDARA：Relative to the negative control group,human melanocytes in the antagonist effect of MK-801 dendritic cells in thin and narrow,two branches significantly reduced agonist NMDA and the AMPA under the action of short and thick dendritic cells,and secondary branches increased significantly(Scale bar,a=20 μm,b =10 μm,c=5 μm )；B ,C：Length of cell dendrites changes under agonists or antagonist of nmdar treatment measured by JEOL Smile View 2.1 software(Scale bar,200 μm;*P<0.05 vs control group)

3 討 論

谷氨酸是主要的興奮性神經遞質。除中樞神經系統外，現已證實表皮內亦存在谷氨酸信號通路。不僅占表皮主要細胞成分的KCs內有谷氨酸受體表達，并且目前有研究發現MCs內亦存在谷氨酸信號通路。已證實離子型谷氨酸受體NMDAR2A、2C及AMPAR在MCs內有表達。并發現AMPAR拮抗劑可下調MCs內MITF(Microphthalmia- associated transcri- ption factor)基因的表達[10]。提示該信號通路與MITF基因具有相互作用。而大量研究發現MITF對于MCs增殖等多種生物學功能具有調節作用。MCs內高表達的MITF可促進細胞分化，惡性黑素瘤內MITF上調可抗惡黑細胞增殖[11]；同時有研究發現白癜風患者皮損處的表皮組織內，MITF及BCL-2的mRNA水平較白癜風患者非皮損處明顯下降[12]。因此，作者推測谷氨酸信號通路可能通過MITF參與白癜風的發病。

白癜風的發病過程中表皮MCs受損，從而導致具有正常生理功能的MCs的數目下降，但其具體發生機制目前尚不十分清楚[13]。Tobin等[14]研究了白癜風患者的皮損發現即使在穩定期的發病20年以上的患者的皮損處仍存在部分MCs。從皮損處發皰取表皮，仍可在體外培養出有產生黑素功能的MCs，提示當致病因素排除后MCs可恢復功能。一項在泛發性白癜風患者及正常對照的臨床研究中發現，患者皮損處經摩擦后MCs變圓并部分脫離基底層，“脫落”至棘細胞層及顆粒細胞層，而患者的正常皮膚或正常對照組則較少或無MCs移入表皮現象。推測白癜風發病過程中皮損處MCs數量的減少可能與“脫落”現象有關，而后者可能與MCs變圓等形態學改變有關[15]。本研究發現在NMDAR拮抗劑MK801作用下，可使MCs產生樹突變細以及二、三級細胞樹突明顯減少等超微結構的變化，推測這種超微結構的變化有可能是造成MCs的遷移及脫落的原因。同時，近期有多項研究發現谷氨酸信號通路與淋巴細胞的功能有關[16-18]。本研究結果提示，谷氨酸信號通路的調節異常可能為白癜風的發病機制之一,探討其作用機制對于色素異常性皮膚病的治療具有重要意義。

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