P33ING1在膀胱移行細胞癌中的表達及其與腫瘤細胞凋亡的研究

楊承綱 胡早秀 陳 蕓

膀胱癌是泌尿生殖系統中最常見的惡性腫瘤，其中90% 以上是膀胱移行細胞癌(bladder transitional cell carcinoma,BTCC)。Garkavtsev等[1]采用在消減cDNA雜交(substractive hybridization)的基礎上，結合GSE(genetic suppressor element)方法，克隆出1個新基因命名為inhibitor of growth 1(ING1)，ING1基因的主要蛋白翻譯產物為P33ING1 蛋白。我們采用鏈霉素抗生物蛋白-過氧化酶免疫組化染色(lablled streptavidin biotin,SP)法，檢測P33ING1在膀胱移行細胞癌中的表達，采用TUNEL法檢測細胞凋亡，并探討P33ING1與細胞凋亡的關系及其在膀胱移行細胞癌發生發展中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集云南省腫瘤醫院病理科2000年1月～2007年10月收治的83例膀胱移行細胞癌組織及11例正常膀胱黏膜組織。83例BTCC中，男性63例，女性20例，年齡35～84歲，平均年齡59.5歲。病理檢查前均未接受過放療和化療，術后均進行化療藥物膀胱灌注。按WHO病理組織學分級標準，G129例，G231例，G323例；Tis～T1期(淺表性腫瘤)51例，T2～T4期(浸潤性腫瘤)32例。所有標本均經10%福爾馬林液固定、石蠟包埋，4 μm厚連續切片。術后隨訪16個月～5年，平均38個月，失訪5例，腫瘤復發或轉移56例，死亡2例，無復發或轉移20例。

1.2 方法

1.2.1 羊抗人p33ING1 單克隆抗體為Santa Cruz Biotechnology公司產品，抗體稀釋度為1∶50,SP染色試劑盒、DAB顯色劑、抗體稀釋液購自福州邁新公司。采用S-P法進行免疫組化染色，嚴格按照試劑盒說明書操作。用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

結果判定： p33ING1陽性大多數定位于細胞核，少數定位于細胞質，陽性染色呈棕黃色顆粒。結果判定參照文獻[2]，每例在光鏡下(400×)計數腫瘤細胞中陽性細胞百分比。陽性細胞數<10%為陰性，≥10%為陽性。

1.2.2 細胞凋亡檢測 末端脫氧核苷酸轉移酶介導的x-dUTP切口末端標記(terminal deoxynucleotide transferase mediated dUTP-nick end labeling method,TUNEI法)試劑盒購于福州邁新公司。

切片脫蠟水化，3%H2O2清除內源性過氧化酶10 min，蒸餾水洗滌2 min×3次；加TBS 1∶100蛋白酶K，37℃消化10 min，蒸餾水洗滌2 min×3次；每片加TDT和DIG-d-UTP各1 μl，標記緩沖液18 μl，40℃冰箱過夜，TBS洗2 min×3次；加封閉液50 μl，室溫30 min；封閉液1∶100生物素化地高辛抗體50 μl，37℃反應30 min；TBS洗2 min×3次；加TBS 1∶100稀釋SABC，37℃反應30 min；TBS洗5 min×4次；DAB顯色，蘇木精襯染，脫水、透明、封片。實驗中以不含TDT的試劑作為陰性對照。

結果判定：TUNEL法檢測陽性表現為在腫瘤組織中散在分布胞核呈棕黃色顆粒著色的細胞。在400倍光鏡下，隨機選擇10個視野并計數1 000個腫瘤細胞，記錄凋亡細胞數。計算細胞凋亡指數(AI)，AI=(凋亡細胞數/1 000)×100%[3]。

1.3 統計方法

2 結果

83例膀胱移行細胞癌中,49例(59.03%) P33ING1表達陽性，AI=1.4335±0.3863。83例標本中，凋亡細胞范圍為0～27個‰。AI表達正常膀胱黏膜組織明顯低于BTCC組織(P<0.01)。在BTCC組織中，AI水平隨其病理分級的增高而增高，各級間差異有顯著性(P<0.01)；Tis～T1期AI水平明顯低于T2～T4期(P<0.01)；復發死亡組AI水平明顯高于無復發組(P<0.05)。AI與BTCC病理分級及臨床分期呈正相關關系(表1)。

表1 AI 與BTCC組織臨床病理參數的關系

2.1 P33ING1蛋白表達及AI與膀胱移行細胞癌臨床病理參數的關系

P33ING1蛋白表達G1、G2與G3比較差異有顯著性(P<0.05)，G1與G2比較差異無顯著性 (P>0.05)；G1、G2與G3比較及Tis～T1與T2～T4比較AI均有顯著性差異(P均<0.01)。5年復發死亡組AI顯著高于無復發組；P33ING1蛋白表達率復發死亡組顯著低于無復發組。相關分析發現,P33ING蛋白表達與BTCC病理分級及臨床分期呈負相關關系(γ=-0.263,P=0.016；γ=-0.388,P=0.001)；AI與BTCC病理分級及臨床分期呈正相關關系(γ=0.642,P=0.000；γ=0.455，P=0.000)；AI與P33ING1蛋白表達無相關性，見表2。

表2 P33ING1表達及AI與BTCC臨床病理參數及預后的關系(例，%)

2.2 P33ING1蛋白表達與AI的關系

P33ING1陽性表達者AI(1.5255±0.4298)顯著高于P33ING1陰性表達者(1.2924±0.3185),P<0.05。

3 討論

ING1 基因是1種重要的抑癌基因，定位于人類染色體13q33-34，由外顯子1a和外顯子2轉錄翻譯出的P33ING1蛋白是ING1基因的主要蛋白翻譯產物 。體外實驗發現，P33ING1表達降低可使細胞生長加快，而過表達可抑制細胞生長，促進細胞凋亡，對細胞周期起負調控作用[4]。其與p53有相互依賴作用，參與p53介導的多種轉錄調控活動，能抑制細胞生長、誘導細胞凋亡及促進損傷修復。其低表達則可刺激克隆形成，促使細胞惡性轉化，導致腫瘤發生[5]。Helbing等[6]通過無血清培養的細胞死亡敏感試驗，證實P33ING1 有促細胞凋亡的作用。Nouman等[7]證實P33ING1 與p53基因是相互協同、相互依賴的方式，通過激活p21/WAF1的轉錄來對細胞生長起負反饋調節作用，兩者一起表達才能起抑制細胞增殖，認為P33ING1 的異常表達阻止了p53促進細胞凋亡，從而形成了腫瘤。有研究報道P33ING1蛋白在人的頭頸部鱗癌、胃癌、結腸癌及乳腺癌中均有ING1基因表達下降[8]。本研究中發現，P33ING1表達在正常對照組中陽性率為90.9%,而在膀胱移行細胞癌中陽性率為50.3%，表達強度明顯降低，差別顯著，與以上文獻報道的一致，表明P33ING1失表達在膀胱癌的發生發展中可能起重要作用。祝峙等[9]采用脂質體方法，將P33ING1與wtp53基因分別轉染人HepG2、PLC/PRF/5和HeP3B三株內源性p53基因表達狀態各不相同的肝癌細胞株，以探討P33ING1與p53基因間的協同功能對肝癌細胞生長、阻滯細胞周期、誘導腫瘤細胞凋亡的影響，結果發現：在表達內源性wtp53的HepG2細胞中導入外源性P33ING1基因，使P33ING1 蛋白在HepG2細胞內過表達，Western印跡結果顯示在HepG2細胞內，隨著P33ING1 蛋白表達量升高，p53蛋白表達也增強。過表達P33ING1 使HepG2細胞凋亡率上升。本實驗結果為P33ING1陽性表達者AI顯著高于陰性表達者，與以上文獻報道的一致。

本實驗結果表明，P33ING1蛋白表達 G1、G2與G3間比較差異有顯著性，G1與G2比較差異無顯著性；P33ING1蛋白在Tis～T1與T2～T4間表達有顯著性差異。提示P33ING1蛋白高表達多發生在分化好及淺表的膀胱癌中。AI在G1、G2與G3間表達及Tis～T1與T2～T4間表達有顯著性差異，提示在分化差及浸潤性膀胱癌中細胞凋亡率上升。復發死亡組顯著高于無復發組；P33ING1蛋白表達復發死亡組顯著低于無復發組。相關分析發現,P33ING蛋白表達與BTCC病理分級及臨床分期呈負相關；AI與其病理分級及臨床分期呈正相關。提示在膀胱癌中AI高P33ING1低表達者的預后較差。P33ING1陽性表達時AI顯著高于陰性表達時，但其與AI無相關性，提示過表達P33ING1 使膀胱癌細胞凋亡率上升，但細胞凋亡是1個復雜的過程，是多因素多環節的結果，并不是由幾個基因所決定的。本實驗結果提示，P33ING1失表達在膀胱癌的發生發展中可能起重要作用，檢測p33ING1水平的變化情況可能有重要的意義。同時檢測AI的狀態和p33ING1表達水平,對于膀胱癌的預后判斷可能具有積極意義。

[1] Garkavtsev I，Kazarov A，Gudkov A，et a1.Suppression of the novel growth inhibitor p33/INGI promotes neoplastic transformation〔J〕.Nature Genet，1996，14(4)：415.

[2] 李啟忠,王向陽.P33ING1b在膀胱移行細胞癌中的表達及其意義〔J〕.國際外科學雜志2007,34(6):376.

[3] 王自軍，陳世昌，劉建東.43例膀胱移行細胞癌細胞凋亡指數的分析〔J〕.寧夏醫學院學報.2004，26(1)：22.

[4] Garkavtsev I，Riabowol K.Extension of the replicative life span of human diploid fibroblasts by inhibition of P33 INGI candidate tumor suppressor〔J〕.Mol Cell Bid，1997，17(4)：2014.

[5] 曾凡軍,周媛媛.p33ING1與非小細胞肺癌相關性的研究進展〔J〕.山東醫藥，2009，49(3)：113.

[6] Helbing CC，Veillette C，Riabowol K，et a1.A novel candidate tumor suppression P33/INGI is involved in the regulation of apoptosis〔J〕.Cancer Res，1997，57(7)：1255.

[7] Nouman GS，Angus B，Lunec J，et a1.Comparative assessment of expression of the inhibitor of growth 1 gene(INGI)in norm al and neoplastic tissues〔J〕.Hybridoma，2002，21(1)：1.

[8] Tokunage E,M aehara Y,Oki E,et al.Diminished exp ression of ING1mRNA and the correlation with p53 exp ression in breast cancers〔J〕.Cancer Lett,2000,152 (1):15222.

[9] 祝 峙，朱明華，倪燦榮.原發性肝細胞癌癌組織中P33INGIb與P53基因的表達〔J〕.中華醫學雜志，2002，82(19)：1332.