血管內皮生長因子C在食管鱗癌組織中表達及與其臨床病理特征的關系研究

李 華 陳于平 楊捷生 楊衛平 劉迪填

食管癌是我國常見惡性腫瘤之一，但確診時多已是中晚期，故治愈率較低，預后差。淋巴結轉移是其重要的轉移途徑之一，但機制尚未完全清楚。VEGF-C是1種腫瘤細胞分泌的淋巴管生成因子，與多種腫瘤的淋巴結轉移密切相關。本研究通過檢測VEGF-C在食管鱗癌中的表達，以探討其與食管癌臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集汕頭大學醫學院腫瘤醫院2007年6月至2009年9月手術切除的食管鱗狀細胞癌標本，共173份。男性131例，女性42例。年齡39～76歲，平均年齡56.9歲，中位年齡57歲。所有患者術前均未接受過放療或化療。按照美國癌癥研究聯合會(AJCC)2002年制定的食管癌TNM分期標準進行術后病理學分期。

1.2 實驗方法

采用Envision Labelled Peroxidase System (ELPS) 二步法，檢測食管鱗癌組織中VEGF-C蛋白的表達情況。

1.3 主要抗體和試劑

一抗兔抗人VEGF-C購自北京中杉金橋生物技術有限公司，原液來自美國ZYMED Laboratories Inc分裝產品。標記二抗及DAB試劑盒購自上海長島生物有限公司。

1.4 免疫組化步驟

所有標本經常規石蠟包埋，4 μm厚度連續切片。常規脫臘置水。蒸餾水洗3次，每次 3min。3%過氧化氫封閉10 min，以消除內源性過氧化物酶。采用pH=6.0的0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液微波修復抗原15 min。兔抗人VEGF-C (工作濃度為1∶70)4℃濕盒過夜。PBS洗3次，每次5 min。加酶標通用型二抗，37℃孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min。DAB顯色。蘇木精復染細胞核，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以結腸腺癌組織作為陽性對照，用PBS和正常兔血清代替一抗作為陰性對照。

1.5 結果判定方法

在400倍光鏡下隨機選取5 個視野，按照下述方法評分,取平均值。細胞質無著色為0 分,呈淡黃染色為1 分,呈棕黃色為2 分,呈棕褐色或胞質內有棕黑色顆粒為3 分。陽性細胞數< 5 %為0 分,5 %～25 %為1 分,26 %～49 %為2 分,50 %～74 %為3 分,≥75 %為4 分。兩者相加之和為實驗結果。陽性細胞數<5 %為陰性(-)；陽性細胞數>5 %、胞質呈淡黃色及總分< 3 分為弱陽性(+)，總分3～5 分為陽性(++),總分≥5 分為強陽性(+++)。

1.6 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件包進行統計學分析。采用χ2檢驗分析VEGF-C與食管癌臨床病理特征的關系。

2 結果

2.1 食管癌組織中VEGF-C表達情況

VEGF-C在食管癌組織中表達于胞質，呈棕黃色顆粒狀，呈灶性或彌漫性分布，多出現在癌巢的邊緣部位。173例食管癌組織中，VEGF-C表達陽性者144例(83.2%)，其中VEGF-C(+++)32例(18.5%)，VEGF-C(++)48例(27.8%)，VEGF-C(+)64例(37.0%)。

2.2 VEGF-C表達與食管癌臨床病理特征的關系(表1)

3 討論

腫瘤的浸潤和轉移是受多因素調控的多步驟的復雜過程，淋巴結轉移是惡性腫瘤轉移的主要途徑之一。研究食管癌淋巴轉移的機制、早期檢測和控制已成為食管癌防治的1個重要環節。長期以來，由于缺乏淋巴管特異性標志物，人們對淋巴結轉移的研究一直滯后于血道轉移的研究。1996年Joukov等[1]首次從人類前列腺癌細胞株PC-3的cDNA文庫中克隆并分離出血管內皮生長因子C(VEGF-C)。人VEGF-C基因位于4q34上，編碼產物為419個氨基酸殘基的蛋白，分子量為46.9 κD。VEGF-C屬于生長因子中的血管內皮生長因子/血小板衍生生長因子(VEGF/PDGF)家族，也是VEGF家族中第1個被發現可促進淋巴管生長的因子，它可通過自分泌或旁分泌的形式，與受體結合，具有調節血管生成、淋巴管生成和脈管通透性等作用。VEGF-C受體有VEGFR-2和VEGFR-3兩類。在成人期，VEGF-C與VEGFR-2結合促進內皮細胞增殖的能力已明顯減弱，而VEGFR-3在胚胎早期血管中有廣泛的表達，但在胚胎發育后期和出生后則僅限于淋巴管內皮細胞中有表達[2]。因此,在成人期,VEGF-C只特異性地與表達于淋巴管內皮細胞中的VEGFR-3結合,激活VEGFR-3膜內區的酪氨酸激酶，使得受體發生自身磷酸化,活化細胞骨架蛋白paxillin，促進內皮細胞的遷移；同時還可激活Ras/MAPK信號傳導通路或c-jun氨基末端激酶通路，誘導淋巴管內皮細胞肌動蛋白重組，刺激其增殖、遷徙，并形成淋巴竇。從而促進淋巴管的新生或擴張，并可降低淋巴管內皮細胞間的黏附，提高淋巴管的通透性。增生的淋巴管增加了與腫瘤細胞接觸的面積，從而促進了腫瘤的轉移。

表1 VEGF-C表達與食管癌臨床病理因素的關系(例)

食管癌的首選治療方法是手術治療，但其5年生存率僅為20%～30 %，轉移和復發是治療失敗的主要原因。如能抑制VEGF-C的表達或應用VEGFR-3的中和抗體、可溶性細胞外片段或低分子量抑制物抑制VEGF-C/VEGFR-3信號傳導通路，則有可能抑制食管癌淋巴管的生成，進一步抑制食管癌發生淋巴結轉移。已有研究表明，阻斷VEGF-C和VEGFR-3的結合可抑制VEGF-C促進腫瘤細胞通過淋巴管轉移的作用[3]。

本實驗應用免疫組織化學技術，對173例食管鱗癌的VEGF-C蛋白表達情況進行檢測，發現VEGF-C表達率高達83.24%，提示VEGF-C在食管鱗癌組織中高表達。本研究還發現早期食管癌組織和進展期食管癌組織中VEGF-C的表達強度有顯著性差異，提示VEGF-C表達強度可能隨著食管癌的發生和進展而逐漸增強。已有研究表明VEGF-C表達在正常食管黏膜經Barrett食管到腺癌的過程中有逐漸增強的趨勢[4]。

本研究還發現，VEGF-C表達與患者年齡、性別、血型、家族史、腫瘤部位、腫瘤長度、病理分型、浸潤深度及病理學分級無相關性，而與淋巴結轉移及病理分期有關。提示VEGF-C蛋白的表達與食管癌淋巴結轉移及其淋巴結受累程度密切相關。這與在甲狀腺癌、前列腺癌、胃癌、結直腸癌、肺癌的研究結果相似，這些研究都發現了VEGF-C的表達水平與淋巴結轉移高度相關[5]。由于淋巴結轉移是預測食管癌預后的1個明確指標，所以VEGF-C將來有可能作為間接預測食管癌預后的1個指標。

總之，VEGF-C在食管癌中高表達，并通過誘導食管癌淋巴管的生成來促進淋巴結轉移。因此，檢測食管癌中VEGF-C的表達可作為判斷是否發生淋巴結轉移的1個重要的生物學指標。VEGF-C有可能成為食管癌臨床治療的1個新的靶點。

[1] Joukov V,Pajusola K,Kaipainen A,et al.A novel vascular endothelial growth facter,VEGF-C,is a ligand for the Flt4(VEGFR-3) and KDR(VEGFR-2) receptor tyosine kinases 〔J〕.EMBO J，1996,15(2):290.

[2] Nisato RE,Tille JC,Pepper MS,et al.Lymphangiogenesis and tumor metastasis〔J〕.Thromb Haemost,2003,90 (4):591.

[3] Li EX，Shi F，Wu YY,et al.The relationship between lymphatic metastasis and serum vascular endothelial growth factor C and cyclooxygenase 2 expression in breast cancer 〔J〕.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88：88.

[4] Auvinen M I,Sihvo E I T,Ruohtula T,et al.Incipient angiogenesis in Barrett，s epithelium and lymphangiogenesis in Barrett，s adenocarcinoma 〔J〕.Clin Oncol,2002,20(13):2971.

[5] Jussila L,Alitalo K.scular growth factors and Lymphangiogenesis 〔J〕.Physiol Rev，2002,82(3):673.