去甲斑蝥素對人肝癌HepG2細胞生長抑制作用的實驗觀察

常 城 朱尤慶 梅娟娟

原發性肝癌作為1種發病率較高的消化道腫瘤[1]，由于患者早期無癥狀，大多數人就診時已是晚期，故其預后差、死亡率高。化療是治療肝癌必不可少的手段之一，但大多數化療藥物由于毒副作用大而限制了其臨床應用。因此尋找高效、低毒的抗痛藥，仍是目前國內外腫瘤研究的熱點。

斑蝥為芫青科昆蟲南方大斑蝥或黃黑小斑蝥的干燥蟲體，在 《本經》中稱其性味辛、寒，有大毒，歸 肝、腎、胃、大 腸、小腸經，具有攻毒蝕瘡，逐瘀散結的功效。斑蝥(cantharidin,CA)抗癌的主要有效成分為斑蝥素，對原發性肺癌、乳腺癌、消化道腫瘤等有一定療效，但由于對胃腸道等的毒性作用限制了其在臨床上的應用。去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)系根據斑蝥素的化學結構，去1、2位甲基合成而得，不僅具有顯著的抗癌作用，且毒副作用較小，同時具有升白、保護肝細胞、調節免疫功能等作用。臨床上主要用于治療乳腺癌、食管癌及胃癌等[2～5]。鑒于肝癌的高發病率及NCTD在腫瘤治療中的重要作用，本研究探討了NCTD對肝癌HepG2細胞的生長抑制作用和誘導凋亡作用，為進一步探討其作用機制打下基礎 。

1 材料與方法

1.1 材料

NCTD購自Sigma公司；噻唑藍(MTT)﹑二甲基亞砜(DMSO)和碘化丙錠(PI)為南京凱基生物技術發展公司產品；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司；胎牛血清和RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司；蛋白酶 K (Proteinase K)購于碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人肝癌HepG2細胞由武漢大學中南醫院腫瘤實驗中心提供。復蘇后置于含有10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養液中(內含青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)，37℃、5% CO2加濕細胞培養箱內培養。

1.2.2 細胞生長抑制率的測定 采用MTT法檢測細胞增殖情況。取對數生長期HepG2細胞調增細胞濃度為1×105/ml。取96孔板，每孔加入200 μl上述細胞懸液。培養24 h后棄去培養液，加入不同濃度NCTD使終濃度為5、10、20和40 μg/ml，每濃度設3個復孔,分別培養24、36、48 h后，棄上清。每孔加入DMSO 150 μl，震蕩均勻，測 A570 nm值OD值，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率 (%)= (1-實驗組OD值均數 /對照組OD值均數)×100%。

1.2.3 流式細胞儀分析細胞周期 收集對數生長期細胞，計數調整細胞數為1×105/ml,實驗組加入NCTD，終濃度分別為5、10、20和40 μg/ml，同時設立陰性對照，相同條件下培養24 h，收集細胞，1 000 r/min離心5min,PBS洗2次，70%乙醇固定，應用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.4 透射電鏡檢測 將細胞分為對照組和藥物組(NCTD 20 μg/ml)作用24 h后，消化細胞后將混懸液移入錐形塑料管中，1 000 r/min離心5 min,棄去上清液，加入胎牛血清1～2滴，離心5 min，棄去上清，沿管壁加入戊二醛固定液，4℃下預固定30 min，用細針管沿管壁在標本周圍輕劃使成團塊狀，使固定液充分滲入標本底部，繼續固定2 h，然后按照常規電鏡標本制作方法處理標本，透射電鏡下觀察。

1.3 統計學方法

實驗數據應用SPSS 13.0統計分析軟件進行方差分析，統計方法采用方差分析和t檢驗。

2 結果

2.1 NCTD對HepG2細胞生長的抑制作用

不同濃度NCTD作用HepG2細胞24、36及48 h后的細胞生長抑制率曲線見圖1。由圖1可見，隨著NCTD濃度升高，HepG2細胞生長抑制率逐漸升高。當40 μg/ml NCTD作用細胞48 h后，細胞生長抑制率達到80%以上。

2.2 NCTD對HepG2細胞周期的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，不同濃度NCTD作用HepG2細胞24 h后，G2/ M期細胞增多,而S期和 G0/ G1期細胞減少，各濃度細胞周期分布情況見表1。

2.3 NCTD誘導HepG2細胞凋亡

HepG2凋亡細胞體積縮小，與正常細胞相比核質比例增大，可見核仁或較大濃縮核小體，染色質濃聚成塊狀和球狀沿核膜排列。

圖1 不同濃度NCTD作用HepG2細胞24、36、48 h細胞的生長抑制曲線

表1 NCTD作用24 h對HepG2細胞周期的影響

注：與a組比較,b、c、d、e組P均<0.05；與b組比較，c、d、e組P均<0.05；與c組比較,d、e組P均<0.05；與d組比較,e組P<0.05

3 討論

腫瘤的發生是1個多步驟發展、多基因參與的復雜過程。從分子生物學角度看，腫瘤的發生是由于原癌基因的激活和抑癌基因的失活擾亂細胞正常增殖和凋亡，導致細胞異常增殖和凋亡減少的結果[6,7]。因此，對于腫瘤的治療，一方面可以通過阻斷腫瘤細胞周期，抑制其分裂增殖；另一方面可以通過促進細胞凋亡來達到治療目的。

本實驗通過MTT法發現，NCTD對肝癌HepG2細胞的生長有抑制作用，各濃度組和各時間段抑制率的比較均有統計學意義，且呈明顯的劑量-時間依賴性。惡性腫瘤的無限制增殖與細胞增殖周期的失控有關，細胞周期調控與細胞周期不同時相間存在的關鍵調控點密切相關。本實驗采用流式細胞技術發現，NCTD處理組HepG2細胞出現G2/M細胞數量增加，S期和G0/G1期細胞數量減少，提示NCTD可將細胞阻滯在G2/M期，使細胞不能進入分裂期，從而使腫瘤細胞的體外增殖受到抑制。

細胞凋亡是由基因編碼調控的細胞主動自殺過程，既是生物體維持自身穩定平衡的1個重要機制，也是消除異常增殖細胞的重要途徑，在腫瘤細胞的生成與丟失中起重要作用[8，9]。因此，誘導腫瘤細胞凋亡成為近年來腫瘤治療的新靶點[10]。腫瘤細胞凋亡的特征及其對治療的反應，揭示了其在腫瘤學方面的意義。腫瘤凋亡特征是核酸內切酶活化，染色體DNA降解，導致小分子DNA漏出，產生亞二倍體以及細胞固縮、凋亡小體形成。應用PI熒光染料標記DNA，于流式細胞儀上可檢測到G1期峰前的亞二倍體峰，及凋亡峰。本研究采用流式細胞儀檢測到NCTD處理肝癌HepG2細胞24 h后可見HepG2細胞形成的“凋亡峰”。透射電鏡觀察細胞凋亡是細胞凋亡研究的經典方法。本實驗20 μg/ml NCTD作用HepG2細胞細胞24 h后，細胞體積縮小，染色質呈團塊聚集于核膜周圍，出現了凋亡的形態學改變，進一步證實了NCTD誘導肝癌HepG2細胞凋亡的作用。

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