Adinbitor對B16黑色素瘤細胞增殖、凋亡及遷移能力的影響

徐躍飛 任 鳳 趙寶昌

蛇毒去整合素(disintegrins)是一類從出血性蛇毒中分離出的含RGD(Arg-Gly-Asp，RGD)或KGD(Lys-Gly-Asp，KGD)模體的小分子蛋白質。此蛇毒蛋白家族可憑借其RGD分子序列而成為細胞外基質與細胞整合素間結合的強有力的競爭拮抗劑，具有抑制血小板聚集和血管新生、腫瘤轉移等功能[1～3]。Adinbitor是本實驗室從中國旅順白眉蝮蛇的毒腺中通過基因克隆的方法獲得的1種含有RGD模體的去整合素，經實驗證實，它具有抑制血小板聚集和血管新生功能，并具有顯著抑制腫瘤生成的作用[4]。本研究旨在研究Adinbitor對B16黑色素瘤細胞增殖、凋亡及遷移的影響，為其研制開發成新的抗腫瘤藥物提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑

Adinbitor克隆于大連產白眉腹蛇毒腺[5]，由本實驗室保存。B16黑色素瘤細胞購自中國科學院上海細胞庫。DMEM細胞培養基購自GIBCO BRL公司；新生小牛血清購自聯星科技生物公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)為Amresco產品；細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒購自碧云天生物技術研究所。纖連蛋白(fibronectin，FN)購自北京醫科大學細胞生物學教研室；Transwell購自Corning Costar 公司。

1.2 細胞培養

B16黑色素瘤細胞于含已滅活的10%新生小牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、105U/L青霉素和0.1 g /L鏈霉素“雙抗溶液”的DMEM培養基(pH 7.2)中，以37℃、5% CO2和90%濕度的條件下培養。

1.3 細胞增殖實驗

采用MTT比色法。B16黑色素瘤細胞(2×104cell/well)細胞接種于96孔細胞培養板中，于DMEM中培養24 h。按設定濃度加入Adinbitor(對照加入同量的PBS)繼續培養24 h后，加入培養液量10%的濃度為0.5 mg/ml的MTT繼續培養4 h，吸去培養液，加入與培養液等量的DMSO，振蕩10 min，使結晶充分溶解。于酶聯免疫檢測儀上測定A490。按以下公式計算細胞抑制率。抑制率=(對照孔A490均值-試驗孔A490均值)/對照孔A490均值×100%

1.4 細胞凋亡實驗

將黑色素瘤細胞(3×105cell/well)接種于放置于六孔板中的滅菌蓋玻片上培養過夜,加入0、0.6、1.2和2.4 μmol/L的Adinbitor進行細胞凋亡的誘導,加入0.5 ml固定液，固定10 min,用PBS洗2遍，每次3 min,加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，染色5 min，滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，使細胞接觸封片液，用熒光顯微鏡對細胞進行觀察并拍照。

1.5 細胞黏附實驗

纖連蛋白FN稀釋于PBS中至終濃度0.1 mg/ml。以每孔40 μl包被96孔板，4℃過夜。次日用1%BSA封閉2 h。B16黑色素細胞按1×104cell/well的量接種于96孔板中,設5個復孔，實驗組將Adinbitor濃度為0、2.0、3.5和5.0 μmol/L加入，37℃孵育2 h。PBS洗去未黏附細胞，黏附細胞用4%多聚甲醛-PBS固定10 min，0.4%結晶紫染色10 min，PBS洗去多余染料并干燥后，加入1%SDS溶解細胞，用酶標儀測A570，以A570均值代表黏附細胞數。

1.6 細胞遷移實驗

將DMEM細胞培養液加入Transwell的下室內預熱1 h，用解剖鑷子將細胞培養嵌套固定在培養板的孔壁上，將B16黑色素瘤細胞懸液(1×104cell/well)接種于上室內，加入不同濃度的Adinbitor處理細胞，終濃度分別為0、1.1、3.3和5.5 μmol/L，置37℃，5%CO2培養箱中16 h。將Transwell上表面的非遷移細胞擦掉，4%多聚甲醛-PBS固定10 min，取下帶有細胞的聚碳酸酯膜，反面朝上，以Olympus相差顯微鏡觀察并拍照，每個樣片隨機取4個視野拍照并計數，計算平均值。每組重復5次。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 Adinbitor對B16黑色素瘤細胞凋亡的誘導作用

未經Adinbitor處理的細胞的Hoechst染色淡而均勻，細胞呈均勻分布；而經Adinbitor處理的細胞核因染色質固縮從而結合Hoechst的能力增強，亮度高并且細胞明顯皺縮成團。本實驗以終濃度分別為0.6、1.2、2.4 μmol/L的Adinbitor作用于B16黑色素瘤細胞18 h誘導細胞凋亡，結果隨Adinbitor濃度增加細胞凋亡越發明顯(圖1)。

圖1 Adinbitor誘導B16黑色素細胞調亡引起的細胞核形態變化(Olympus熒光顯微鏡,200×)

2.2 Adinbitor對B16黑色素瘤細胞增殖的影響

Adinbitor對B16黑色素瘤細胞有劑量效應關系。Adinbitor抑制B16黑色素瘤細胞增殖的半效應量(mddian infective dose，ID50)為2.68 μmol/L(圖2)。

2.3 Adinbitor對FN誘導的B16黑色素瘤細胞黏附的影響

2.0、3.5和5.0 μmol/L濃度的Adinbitor作用2 h后，可明顯抑制B16黑色素瘤細胞黏附FN基質，隨著濃度的增加黏附細胞數下降，分別為0.91±0.03、0.82±0.02和0.73±0.01個，各濃度組與對照組(0 μmol/L)的(1.13±0.06)個比較，差異均有統計學意義，P<0.01(圖3)。

圖2 Adinbitor對B16黑色素瘤細胞增殖的影響

圖3 Adinbitor對B16黑色素瘤細胞黏附FN的影響

2.4 Adinbitor對B16黑色素瘤細胞遷移的影響

以對照組(0 μmol/L)，1.1、3.3和5.5 μmol/L濃度的Adinbitor處理B16黑色素瘤細胞16 h后，各組遷移細胞數分別為98.2±8.93、80.1±6.72、58.7±4.12和36.8±3.83個。各濃度組與對照組比較差異均有統計學意義，P值均<0.01。Adinbitor可以抑制B16黑色素瘤細胞遷移能力，且呈明顯量效關系(圖4)。

圖4 Adinbitor對B16黑色素瘤細胞遷移能力的影響

3 討論

腫瘤是1種細胞凋亡過少而增殖過多的疾病，若能抑制腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡，腫瘤細胞就有可能停止生長，因而誘導腫瘤細胞凋亡已成為篩選抗腫瘤藥物1個新的重要指標，開發毒性作用小并可誘導細胞凋亡的抗腫瘤藥物也是腫瘤藥物研發工作者研究的新領域。目前已有多種來自于蛇毒的去整合素被證實除了可以通過抑制腫瘤血管生成達到抗腫瘤的目的外，還可以直接抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞發生凋亡，并且對腫瘤細胞的黏附、增殖、浸潤和轉移均有抑制作用。本實驗采用MTT比色法發現Adinbitor對B16黑色素瘤的抗增殖作用具有藥物劑量依賴關系，其抑制增殖的ID50為2.68 μmol/L。在其誘導B16黑色素瘤細胞凋亡實驗中，通過Hoechst染色證實了Adinbitor具有誘導B16黑色素瘤細胞發生凋亡的功能。實驗結果與國內外類似研究表現了相同趨勢[6,7]。

腫瘤的侵襲與轉移是1個多步驟、多因素參與的復雜過程。腫瘤細胞的黏附在腫瘤的侵襲與轉移中起重要作用，是腫瘤的侵襲與轉移的前題和始動因素。高侵襲的腫瘤細胞與基膜成分的異質性黏附能力通常增高，而腫瘤細胞間的同質性黏附能力會下降。這種特性有利于腫瘤細胞侵犯基膜等組織。本實驗結果顯示，Adinbitor能降低B16黑色素瘤細胞在FN基膜上的黏附，不同濃度的Adinbitor作用2 h后，黏附細胞數下降，表明Adinbitor具有抗黏附作用。

腫瘤細胞從原發部位擴散到遠處器官或組織，首先要降解并穿過基膜浸潤到周緣組織，并進一步降解血管內皮下基膜進入循環，因此遷移是侵襲力必要條件。體外小室細胞培養模型是綜合判斷腫瘤侵襲轉移能力、分析腫瘤細胞黏附、降解和穿透轉移能力及相互間聯系的最有效且較經典的實驗方法。小室內不鋪基膜，觀察穿膜細胞數能檢測腫瘤體外遷移能力。我們用小室法觀察到Adinbitor有較強的抑制B16黑色素瘤細胞遷移的能力，與對照組有顯著性差異(P<0.01)，且有劑量效應關系。

綜上所述，Adinbitor對B16黑色素瘤細胞不僅有顯著的抑制增殖和誘導凋亡的作用，而且有明顯的抑制腫瘤細胞黏附和遷移作用，是具有前途的抗腫瘤藥物，其抗腫瘤的作用機制，還有待進一步深入探討。

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