尿多酸肽對人肺腺癌A549細胞的作用及人肺腺癌A549細胞株E-cadherin基因甲基化的研究

王紅兵 王亞麗 劉德生 徐海洋 裴冬生 祖茂衡

尿多酸肽(CDA-Ⅱ )是從健康人尿中提取經純化制得的，含有多種有機酸和多肽成分，本研究采用MTT法檢測尿多酸肽對A549細胞的作用，甲基化特異性PCR(MSP)檢測人肺腺癌A549細胞株E-cadherin基因甲基化的狀況，以探討尿多酸肽的抗腫瘤作用及作用機制，為肺癌治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

尿多酸肽是由合肥永生制藥公司生產，MTT試劑盒購自Sigma公司，細胞基因組DNA提取試劑盒購自北京天根公司，E-cadherin基因甲基化檢測試劑盒為GENMED公司產品，人肺腺癌A549細胞株購自中國科學院上海細胞所。

1.2 方法

1.2.1 A549細胞培養 取A549細胞用含10%小牛血清DMEM培養液于37℃含5% CO2培養箱培養，3 天更換 1 次培養液。

1.2.2 MTT法測定A549細胞存活率 取指數生長期的A549細胞，每孔1×104個細胞接種于96孔板,實驗組分別加入不同濃度的CDA-Ⅱ，對照組加入等體積的DMEM，37℃含5% CO2培養箱培養24 h。每孔加20 μl MTT溶液于37℃含5% CO2培養箱溫育4 h。吸去上清，每孔加150 μl二甲基亞砜，震蕩約10 min混勻。用酶標儀檢測490 nm 處的吸光度(A490) 值。細胞存活率(%)= (CDA-Ⅱ平均A 值/對照平均A 值)×100%。

1.2.3 甲基化特異性PCR(MSP) 收集不同處理組細胞，參照細胞基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，在UV 3 000紫外分光光度儀上測定吸光度值鑒定DNA純度，A260/A280比值均在1.8～2.0之間。取2 μg基因組DNA參照E-cadherin基因甲基化檢測試劑盒說明書進行甲基化修飾。分別取修飾DNA及未修飾DNA 100 ng進行MSP反應。E-cadherin基因甲基化引物：M，F：5’-TTAGGTTAGAGGG T TATCGCGT-3’，R:5’-TAACTAAAAATTCACCTACCGAC-3’。非甲基化引物：U，F:5’-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT-3’，R:5’-CA CAACCAATCAACAACACA-3’。反應體系按照PCR試劑盒推薦量25 μl體系進行:PCR混合液15 μl，上下游引物各1 μl,模板1 μl。PCR反應時間和溫度：95℃預變性9 min，95℃變性30 s，甲基化引物在57℃退火30 s，非甲基化引物在53℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環擴增35次，72℃ 5 min。使用Gene Amp PCR System 2400擴增儀(美國PE公司)。取10 μl PCR產物在1.8%瓊脂糖凝膠上電泳，以TIANGEN MD 101為標準DNA Marker同步電泳，紫外燈下觀察，凝膠成像系統記錄并分析。M陽性，U陰性為完全甲基化，M陽性，U陽性為部分甲基化，M陰性，U陽性為非甲基化。

1.3 統計學處理

每個實驗重復5次，結果采用SPSS 13.0統計軟件處理。SPSS對MTT數據進行概率單位模型分析，回歸方程經過幾次疊代運算后確定，如方程擬合優度檢驗χ2值、P值(>0.05),說明曲線擬合良好，并顯示各效應概率水平的劑量值(包括0.50,即IC 50 )。

2 結果

2.1 尿多酸肽對A549細胞生長的影響

尿多酸肽顯著抑制人肺腺癌A549細胞生長，隨著劑量的增加其抑制作用增強，2.00 mg/ml 尿多酸肽作用24 h后A549細胞存活率僅為3.9%，半數抑制濃度IC 50為0.23 mg/ml，見表1。

表1 尿多酸肽對A549細胞生長的抑制

注：數值經SPSS軟件分析，χ2=0.098，P=0.999(>0.05)

2.2 A549細胞E-cadherin基因甲基化狀態

A549細胞中E-cadherin基因甲基化狀態為部分甲基化，見圖1。

圖1 E-cadherin基因甲基化檢測(MSP)M為甲基化(117 bp);U為非甲基化(97 bp)

3 討論

尿多酸肽是從健康人尿中經酸化、吸附、洗脫、真空干燥等工藝流程制成的非細胞毒性尿萃取物，含多種有機酸和分子量小于6000 D的多肽(每100 ml含馬尿酸300 mg，苯乙酰谷氨酰胺300 mg，多肽150 mg，4-羥基苯乙酸50 mg，5-羥基吲哚乙酸10 mg；以馬尿酸含量計，其濃度為3 mg/ ml)。近年來，尿多酸肽在抗腫瘤方面的作用逐漸引起人們重視[1]。本實驗選取人肺腺癌A549細胞為靶細胞進行尿多酸肽的抗腫瘤效應研究。在體外實驗中我們采用MTT法檢測不同濃度尿多酸肽作用下A549細胞的存活率。MTT結果顯示尿多酸肽顯著抑制人肺腺癌A549細胞生長，隨著劑量的增加其抑制作用增強。

DNA序列以外的調控機制異常，即表觀遺傳學異常在腫瘤的發生發展過程中的作用普遍受到人們重視。表觀遺傳學包括甲基化狀態、基因組印跡，染色體修飾，組蛋白修飾及microRNA調控狀態等方式，其中甲基化與腫瘤發生關系最為密切，它作為表觀遺傳學的1種調控機制是最早被人們發現的。基因啟動子區域CpG島的甲基化導致的基因表達的失活是表觀遺傳學改變的重要方式之一。抑癌基因的失活在腫瘤的發生中起了重要的作用[2～4]。E-cadherin能抑制腫瘤細胞的浸潤和轉移，被公認為是浸潤、轉移的抑制基因。E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-Cad)作為關鍵的細胞黏附分子，當E-Cad表達下調將使同種細胞失去黏附，正常組織不能發育成形。對于惡性腫瘤而言，則細胞極性喪失、呈現惡性細胞形態并具備侵襲性生長特性[5]。本研究采用甲基化特異性PCR(MSP)檢測人肺腺癌A549細胞株E-cadherin基因甲基化狀況，結果A549細胞株存在E-cadherin基因異常甲基化，呈部分甲基化。

綜上所述，我們通過MTT實驗及MSP檢測初步

證實了尿多酸肽對A549細胞有抑制作用，A549細胞株存在E-cadherin基因的異常甲基化，為下一步研究尿多酸肽的去甲基化作用打下了基礎。

[1] 王曉丹，劉科宇，盧潤章，等.尿多酸肽對高危組骨髓增生異常綜合征細胞株p15INK4B基因的去甲化作用〔J〕.黑龍江醫學,2007,31(12):883.

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[4] Davis CD,Uthus EO.DNA methylation,cancer susceptibility,and nutrient interactions〔J〕.Exp Biol Med,2004,229(10):988.

[5] 鄭本波,彭方興,李 波.甲基化特異性PCR法檢測胰腺癌組織E-cadherin基因甲基化〔J〕.華西醫學,2005,20(2):216.