多發性骨髓瘤患者骨髓間充質干細胞的生物學特性研究

趙志華 趙智剛 陸 寧 王曉芳

骨髓中除了造血干細胞外，還有一類具有干細胞特征的細胞群體，被稱為間充質干細胞(MSCs)。MSCs是骨髓微環境中很重要的組份并發揮著重要作用。既往研究表明MSCs具有支持造血和調控造血干細胞增殖和分化的能力[1,2]。此外，MSCs在不同的誘導條件下可分化為多種組織，如骨骼、軟骨、骨髓基質、肌肉、腱、脂肪和神經細胞等[3,4]。MSCs的上述生物學特性決定了其在組織工程和細胞治療領域的廣泛應用前景。 但是，我們尚不清楚的是：血液病患者骨髓MSCs是否受到疾病的影響以及受影響的程度。因此我們獲取多發性骨髓瘤(MM)患者的骨髓MSCs，觀察其生物學特征和多向分化能力，并檢測其是否表達造血相關因子并具有體外支持造血的能力，為其今后在臨床中的應用提供初步的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

IMDM、DMEM、DF12、MCDB培養基、胎牛血清、馬血清、Trizol裂解液、甲基纖維素均為GIBCO公司產品。鼠抗人CD14、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR抗體購自 BD-PharMingen,鼠抗人Ⅰ、Ⅲ膠原單克隆抗體購自Santa Cruz公司。免疫組化試劑盒購自北京中山公司；胰酶，EDTA,β磷酸甘油和1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤購自Sigma公司。

1.2 病例資料

15例MM患者，其中男性11例，女性4例，平均年齡53歲(46～67歲)，均為天津醫科大學附屬腫瘤醫院住院病例，MM的診斷標準參見文獻[5]。全部15例患者在獲取標本時均未接受過任何化療。8例正常人，平均年齡23歲(14～36歲)，作為對照。

1.3 MSCs的分離、培養和擴增

髂后上棘抽取骨髓5～10 ml，用淋巴細胞分離液(密度1.077)1 200 rpm離心20 min，獲取全部單個核細胞，計數后接種于含40%MCDB、2%胎牛血清(FCS)的DF12培養液中，置37℃、5%CO2培養箱中，24～48 h后換液，去除未貼壁細胞。當細胞達到80%融合，應用胰酶-EDTA消化后按照1∶3比例傳代。

1.4 MSCs免疫表型的檢測

分別取不同代數MSCs，胰酶消化后，用含2%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)制成1×106/ml的細胞懸液。每個上機試管中加入500 μl細胞懸液，加入鼠抗人CD14、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA—DR單克隆抗體，于40℃孵育30 min。再加入FITC標記的羊抗鼠IgG,40℃孵育30 min,PBS洗4遍。流式細胞儀檢測,應用cellquest軟件獲取并分析數據。

1.5 MSCs多向分化能力的檢測

成骨誘導：將5×104個細胞接種于預置玻片的35 mm培養皿中，加入含10-7mol/L地塞米松、10 mol/Lβ磷酸甘油、0.05 mol/L維生素C和10% FCS的IMDM，3周后應用Von cosa染色檢測鈣化小結；脂肪誘導：將5×104個細胞接種于預置玻片的35 mm培養皿中，加入含10-6mol/L地塞米松、0.5 mol/L 1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤、0.1 mol/L維生素C和10%FCS的IMDM，5～7天后油紅O染色檢測脂肪滴。

1.6 MSCs造血因子表達的檢測

用Trizol 裂解液提取總RNA。RT-PCR擴增干細胞因子(SCF)，白介素6(IL-6)，白介素3(IL-3)，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，粒、單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)，單核細胞集落刺激因子(M-CSF)和血小板生長因子(TPO)。管家基因GAPDH作為內對照。反應條件:94℃變性5min后開始循環。94℃變性30 s,60℃退火1 min,72℃延伸1 min,循環35次,72℃延伸5 min。PCR產物行2%瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠染色并觀察結果。

1.7 MSCs支持造血能力的檢測

將骨髓MSCs經60Coγ線10.0 Gy照射，然后接種于長期培養基(含質量濃度12.5% FCS,12.5%馬血清，2 mmol/L谷氨酰胺，10-6mol/L氫化考的松的IMDM)中。獲取健康人骨髓單個核細胞，預先培養4 h以去除貼壁細胞，將懸浮細胞按照1×106/ml接種在照射后的MSCs中，在37℃、 5%CO2中培養,每周半量換液。4周后獲取全部細胞接種于甲基纖維素體系中測定其集落形成能力。培養體系:IMDM中含30%馬血清,1g/L BSA,2 mmol/L谷氨酰胺,1×10-4/L β2 巰基乙醇,1%甲基纖維素和重組細胞因子。細胞因子包括rhSCF 50 ng/ml、IL-3 10 ng/ml、GM-CSF 50 ng/ml 和促紅細胞生成素(EPO) 4 U/ml。集落形成實驗在24孔培養板中進行,每孔接種1×106個細胞,于37℃、 5%CO2培養14天。14天后在倒置顯微鏡下計數集落,50個以上細胞為1個集落。

1.8 統計學分析

采用SPSS11.0軟件進行統計分析，實驗數據用平均值±標準誤表示，組間比較進行t檢驗或方差分析。

2 結果

2.1 MM骨髓MSCs的生物學特征

12例MM患者骨髓中培養出可以連續傳代的MSCs,另外3例MM骨髓單個核細胞經過2周培養，只有很少的貼壁細胞而且幾乎不增殖，隨著繼續培養逐漸死亡。在倒置顯微鏡下，MM骨髓MSCs呈現為成纖維樣，細胞核較大，位于細胞中央，其中可見核仁，細胞生長成漩渦狀形態。在培養過程中，12例標本中均有集落形成單位(CFU-F)形成,CFU-F計數為(10±2.7)/107骨髓單個核細胞[(6～21)/107骨髓單個核細胞;n=12]。MSCs在體外增殖能力強，平均倍增時間為(43.2±5.8)h(36.7～55.1；n=10)，細胞形態和倍增時間隨著細胞的傳代變化不大。MM來源的MSCs表達CD29、CD44、CD105，不表達造血細胞表面抗原CD34和CD45，內皮細胞標志CD31也為陰性，此外CD14和HLA-DR均為陰性。該免疫表型隨著細胞傳代變化不大,免疫組化顯示其表達Ⅰ和Ⅲ型膠原。此外，MM骨髓MSCs的形態、增殖能力和免疫表型與正常成人骨髓MSCs相似。

2.2 MSCs的誘導分化

MM骨髓MSCs和正常成人骨髓MSCs都具有在體外向骨和脂肪細胞分化的能力。在成脂肪誘導體系中，5～7d后可以看見60%～80%細胞中出現脂肪滴，油紅O染色證實為脂肪滴。在成骨誘導體系中培養3周后，細胞呈現多層生長的結節狀，并有大量鈣鹽沉積。Von Kossa 染色證實為鈣鹽沉積(圖1)。分別檢測了不同代數MSCs，發現都具有相同的分化能力。

圖1 RT-PCR檢測MM骨髓MSCs中造血因子的表達

1為Marker；2為IL-6 (174bp)；3為M-CSF (231bp); 4為SCF (275bp)；5為 G-CSF (346bp)；6為TPO (347bp); 7為GM-CSF (384bp); 8為IL-3 (347bp)

2.3 造血相關因子的表達

通過RT-PCR，檢測到SCF、M-CSF、IL-6和G-CSF在MM骨髓MSCs中穩定表達，但是沒有檢測到GM-CSF、IL-3和TPO的表達。隨著細胞傳代，造血相關因子的表達并不發生改變。

2.4 體外支持造血能力

為了評估MM骨髓MSCs支持造血的能力，骨髓單個核細胞被接種于照射過的MSCs中，在長期骨髓培養基中培養4周后檢測CFU生成情況。由圖2可見，MM骨髓MSCs具有促進CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM增殖的能力，以MM骨髓MSCs為滋養層的培養體系中，CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的產率分別為128.2±4.1、69.5±8.6和9.8±3.4；以正常成人骨髓MSCs為滋養層的培養體系中，CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的產率分別為138.6±12.1、85.4±6.3和12.6±0.9；兩者支持造血的能力沒有明顯差別。

圖2 RT-PCR檢測MM骨髓MSCs中造血因子的表達

3 討論

多發性骨髓瘤(MM)是漿細胞在骨髓內惡性克隆性增殖伴單克隆免疫球蛋白產生為特征的1種造血系統惡性克隆性疾病。主要表現為骨髓瘤細胞增殖、浸潤和破壞骨組織及髓外其它組織。多發性骨髓瘤是一中老年惡性疾病,常規化療效果差。大劑量化療聯合自體造血干細胞移植治療效果較好,異基因造血干細胞移植是唯一可以治愈該病的方法。但是大劑量化療或移植前的預處理會損害骨髓中的MSCs，從而影響造血干細胞的植入和移植后患者的造血恢復[6，7]。骨髓MSCs具有在體內和體外支持造血的功能，因此聯合MSCs的造血干細胞移植(HSCT)有可能解決上述問題，最近研究結果發現聯合MSCs的HSCT可以促進造血干細胞的植入和造血恢復[1，2，8]。具有臨床應用潛能的MSCs包括異基因MSCs和自體MSCs。但是，排斥反應、來源有限、增加患者的經濟負擔等因素限制了異基因MSCs的臨床應用。而且研究發現異基因MSCs不能修復被放化療損傷的骨髓基質細胞。因此，我們希望獲取患者自體MSCs用于臨床治療，但是我們尚不清楚骨髓中惡性克隆性增殖的骨髓瘤細胞是否影響與其關系密切的骨髓MSCs。

在本研究中，我們獲取并研究了MM骨髓來源MSCs的生物學特征,同時獲取正常成人骨髓MSCs作為對照。研究結果顯示MM骨髓MSCs具有很強的增殖能力，其倍增時間約為45h，這種生長速度隨細胞連續傳代無明顯變化，這意味著我們獲取的間充質干細胞可以在體外大量擴增。MSCs具有一系列的表面標志，通過對這些表面標志的檢測，我們可以進一步鑒定所獲取細胞的性質。我們用FACS檢測獲取的MM骨髓MSCs的免疫表型，結果顯示該細胞群體表達CD29、CD44和CD105，不表達CD14、CD34、CD31、CD45、和HLA-DR，這與文獻報道的間充質干細胞的免疫表型是一致的[9]。此外，多向分化能力是MSCs的重要特性之一，因此在本研究中我們檢測了MM來源的MSCs在體外向骨、脂肪分化的能力，結果發現在相應的誘導體系中，MM骨髓MSCs可以向骨和脂肪分化，進一步證實在MM患者的骨髓中存在著一類具有MSCs特點的細胞群體。

MM的發病機制目前尚不明了，骨髓微環境中IL-6的升高、抑癌基因的失活和膜受體的改變與該病的發生有著一定關系。本研究中我們發現MM和正常成人骨髓MSCs均穩定表達IL-6,我們進一步通過半定量RT-PCR方法進行比較，發現IL-6在MM和正常成人骨髓MSCs中的表達沒有明顯差別。因此，我們推測MM骨髓MSCs表達IL-6與MM的發病關系不大，而與其支持造血作用相關。

既往研究發現，骨髓MSCs通過表達細胞黏附分子和分泌多種造血調控因子來促進造血干細胞的增殖和分化。在本實驗中，我們發現MM骨髓MSCs高表達黏附分子CD29和CD44，并且表達Ⅰ和Ⅲ型膠原，這些分子的表達有助于MSCs與造血細胞之間的相互黏附，從而促進造血細胞的增殖和分化。此外，MM骨髓MSCs一方面通過穩定表達造血調控因子SCF、IL-6和G-CSF，進一步來調控造血；另一方面作為滋養層來支持造血。在本研究中，我們發現骨髓單個核細胞在以MSCs作為滋養層的骨髓長期培養體系和甲基纖維素培養體系中經過續貫培養后可以生成CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM，說明MM骨髓MSCs具有支持造血干/祖細胞增殖的能力。進一步同正常成人骨髓MSCs比較，MM骨髓MSCs對造血干/祖細胞的增殖能力沒有明顯差別，進而闡明MM骨髓MSCs具有很好的支持造血作用。

綜上所述，我們首次從MM患者骨髓中分離純化出MSCs，它可以在體外大量擴增并維持低分化狀態，在特定的條件下可以向多種組織分化。MM骨髓MSCs具有表達造血相關因子和體外支持造血的作用，因此，是1種理想的可應用于臨床的種子細胞。

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