抗菌肽對高齲患者口內(nèi)變異鏈球菌生長的影響

王麗娜，史 春，劉啟成，牛衛(wèi)東

(大連醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院 口腔內(nèi)科教研室，遼寧 大連 116044)

藥物治療是齲病預(yù)防及治療的方法之一，含氟制劑的使用是目前齲病預(yù)防最常用的方法，但長期使用，可以產(chǎn)生具有更高抗酸力的耐氟菌株，更易引起牙體硬組織的酸蝕脫礦[1]。因此,尋找安全而又有效的生態(tài)調(diào)節(jié)制劑已成為口腔常見感染性疾病防治研究的重點。

抗菌肽是多細胞生物體自身防御體系產(chǎn)生的具有高效廣譜抗菌活性的小分子肽，具有獨特的抗菌機理，是機體賴以對抗微生物感染、在自然界得以生存的重要防御分子，故極有希望開發(fā)成為一類新型的廣譜高效抗菌藥物[2]。但是天然的抗菌肽生物效能低，且具有蛋白水解的不穩(wěn)定性[3]，為了克服這些缺點，模仿抗菌肽的特性，通過較少的改變一些結(jié)構(gòu)人工合成抗菌肽的同型物，為在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)咕牡难邪l(fā)應(yīng)用開辟了廣闊的空間[4]。KSL是研究者依據(jù)天然抗菌肽的特性，采用分子生物學(xué)技術(shù)合成的有較強抑菌性能的新型抗菌肽[5]。體外抑菌實驗表明，KSL對口腔常見致齲菌的最小抑菌濃度為3～100 μg/mL[6]。目前在國內(nèi)尚未見到關(guān)于抗菌肽KSL對變異鏈球菌作用的報道，關(guān)于KSL對臨床分離致齲菌的生長抑制情況的研究亦少見，本文主要研究KSL對高齲患者口內(nèi)變異鏈球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)的生長抑制情況。

1 材料和方法

1.1 抗菌肽KSL的溶液制備

依據(jù)十肽的氨基酸序列：KKVVFKVKFK-NH2[5]，由成都誠諾新技術(shù)有限公司合成并進行質(zhì)譜鑒定,質(zhì)譜分析顯示其分子量為1249.958，高效液相色譜分析顯示其純度為98.22%。用雙蒸水配制濃度為4 mg/mL的KSL溶液，針孔濾器過濾后備用。

1.2 高齲患者口內(nèi)變異鏈球菌的分離與鑒定

選自于大連醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院就診的高齲患者(DMFT≥6)5人，受試者近3個月內(nèi)未服用抗生素，口腔衛(wèi)生良好，無全身系統(tǒng)性疾病，無牙齒結(jié)構(gòu)異常，清洗受試者唇或頰側(cè)釉質(zhì)區(qū)，隔濕、干燥，用無菌刮匙刮取釉質(zhì)光滑面菌斑，置于預(yù)先消毒滅菌，盛有1 mL TE緩沖液中的EP管中立即送檢。將標本置于漩渦振蕩器上震蕩1 min，用PBS緩沖液作10倍系列稀釋，去原液、10-1、10-2、10-3稀釋液各50 μL分別接種于MSB瓊脂培養(yǎng)平板，80%N2、10%H2、10%CO2，37℃下兼性厭氧培養(yǎng)48 h，進行菌落檢測和鏡檢細菌形態(tài)學(xué)鑒定[7]。將具有典型菌落及菌體形態(tài)的單個菌落接種于MSB培養(yǎng)平板進行次代培養(yǎng)，菌落和鏡檢證實為純培養(yǎng)后，再接種至TPY液體培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h，鏡檢證實無污染后用50%甘油TPY液體保種。將國際標準株與甘油保種變異鏈球菌臨床分離株分別接種于TPY培養(yǎng)平板內(nèi)，培養(yǎng)條件同細菌初代培養(yǎng)，收集部分菌落用微量生化板法做生化鑒定，若與標準株相同，認定分離細菌為變異鏈球菌。

1.3 實驗菌株及菌懸液的制備

取變異鏈球菌ATCC 25175(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院惠贈)及高齲患者臨床分離變異鏈球菌的甘油保存液50 μL，接種于固體培養(yǎng)基上，于80%N2、10%H2、10%CO2，37℃下兼性厭氧培養(yǎng)24 h，恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h進行細菌復(fù)蘇。挑取部分菌落革蘭氏染色后光學(xué)顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，證實無污染后傳代培養(yǎng)備用。

無菌接種環(huán)挑取經(jīng)鑒定的純培養(yǎng)單個細菌菌落置于含2 mL液體培養(yǎng)基的康氏管中進行24 h增菌，用磷酸緩沖液(PBS)，使用麥氏比濁管測定細菌濃度，配制成濃度為2×106cfu/mL的細菌菌懸液備用。

1.4 最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)測定

實驗分組：陰性對照組：不含藥物的菌懸液培養(yǎng)基，每組四個平行；陽性對照組：含0.1%洗必泰的菌懸液培養(yǎng)基，每組四個平行；實驗組：含不同濃度的KSL菌懸液培養(yǎng)基，每組三個平行。

將濃度為4 mg/mL的KSL按2倍稀釋法溶于液體培養(yǎng)基中，使其終濃度為2.0000、 1.0000、0.5000、0.2500、0.1250、0.0625、0.0313、0.0156 mg/mL。濃度為2×106cfu/mL菌懸液與各組藥液按比例(v/v)，各100 μL分別接種于96孔板中，使菌懸液終濃度為1×106cfu/mL，用微量震蕩器震蕩1 min后，置于各自的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)24～48 h。在黑色背景下，以肉眼觀察無渾濁出現(xiàn)的最小抑菌濃度(MIC)值。選擇大于MIC濃度的各孔，分別取20 μL涂布于固體培養(yǎng)基上，相同條件下培養(yǎng)，觀察菌落數(shù)少于5～6個的最低濃度為最低殺菌濃度(MBC)[8]。所有菌種的MIC測定實驗重復(fù)3次。

1.5 KSL對變異鏈球菌殺菌曲線的測定

將200 μL的S.mutans標準株菌懸液加入含2×MIC濃度的KSL的TPY液體培養(yǎng)基(實驗組1)、S.mutans臨床株菌懸液加入含2×MIC濃度的KSL的TPY液體培養(yǎng)基(實驗組2)、0.1%洗必泰的TPY液體培養(yǎng)基(陽性對照組)及TPY液體培養(yǎng)基(陰性對照組)中，菌懸液與TPY液體培養(yǎng)基的比例為1∶9(v/v)，S.mutans的終濃度為1×106cfu/mL。80%N2、10%H2、10%CO2，37℃下兼性厭氧培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、5、10、20、30、60、120、240 min提取菌液。PBS緩沖液梯度稀釋(0、10、100、1000倍)后取50 μL菌液涂布于TPY固體培養(yǎng)基上，用ProtoCOL SR 全自動菌落計數(shù)儀計數(shù)菌落數(shù)。菌落數(shù)(cfu/mL)的對數(shù)值(log)為縱坐標，時間為橫坐標。作圖繪制生長曲線?；罹嫈?shù)減少99.9%即差異>3 log10cfu/mL者視為有殺菌作用，活菌計數(shù)下降1～3 log10cfu/mL者視為有抑菌作用[9]。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 高齲患者口內(nèi)變異鏈球菌的分離與鑒定

肉眼見MSB瓊脂平板上典型變異鏈球菌菌落為嵌入瓊脂、質(zhì)硬、突起、表面粗糙。經(jīng)革蘭染色，油鏡(10×100)下可見變鏈菌菌落為G+小球菌，呈長鏈狀或短鏈狀，成隊或分散排列。細菌生化反應(yīng)結(jié)果與變異鏈球菌標準株各個生化試劑反應(yīng)結(jié)果相似，見表1。其中5例被檢菌斑中有3例分離出變異鏈球菌，本實驗選取其中1例的臨床株作為實驗菌株。

表1 變異鏈球菌生化鑒定結(jié)果Tab 1 Biochemical identification results of S.mutans

2.2 最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)值的測定

抗菌肽KSL對變異鏈球菌標準菌株及高齲患者臨床分離株的MIC均為0.0625 mg/mL，MBC值為0.1250 mg/mL及0.2500 mg/mL，表明KSL對標準株及臨床分離株的抑菌效果相似,見表2。

表2 KSL對S.mutans標準株及臨床分離株的MIC及MBC值Tab 2 MIC and MBC of KSL on S.mutans standard strains and clinical isolated strains

2.3 KSL對變異鏈球菌殺菌曲線的測定

陰性對照組在這4 h之內(nèi)細菌的數(shù)量變化不明顯，0.1%洗必泰陽性對照組在10 min后完全殺滅細菌。2×MIC濃度的KSL，在5 min內(nèi)就能夠減少S.mutans標準株的數(shù)量，20 min可達到殺菌效果，30 min后可完全殺滅細菌；2×MIC濃度的KSL，在10 min能夠明顯減少S.mutans高齲患者臨床株的數(shù)量，20 min后亦可達到殺菌效果，1 h之后能完全殺滅細菌，KSL要完全殺滅高齲患者口內(nèi)的變異鏈球菌，所需時間要長于標準菌株，見圖1。

圖1 抗菌肽KSL對變異鏈球菌的殺菌曲線Fig 1 Bacteria kill curve of Antimicrobial peptide KSL on S.mutans

3 討 論

20世紀90年代末期，有研究者開始探索抗菌肽對口腔微生物的作用，目前有關(guān)研究逐漸增多。天然抗菌肽生物效能低，且具有蛋白水解的不穩(wěn)定性。近年的研究表明，人工合成抗菌肽比天然抗菌肽更顯優(yōu)勢。KSL為在人工合成的多肽菌庫中，有較強的抑菌作用的新型抗菌肽。體外抑菌實驗表明KSL能完全殺死白色念珠菌，同時對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球、大腸桿菌等都有較強的抑菌殺菌作用，對口腔常見致齲菌的最小抑菌濃度為0.03～0.1 mg/mL[6]。KSL的體外細胞毒性實驗說明KSL只針對原核生物界，而對哺乳動物細胞并無毒性。

變異鏈球菌是主要致齲菌，從高齲患者口內(nèi)分離變異鏈球菌，研究KSL對臨床菌株的抑菌效果，對KSL今后的臨床應(yīng)用有著指導(dǎo)意義。本實驗采用經(jīng)典的培養(yǎng)法及生化鑒定方法，成功的分離出變異鏈球菌3株，選取其中1株作為實驗菌株，保證了實驗的順利進行。實驗采用美國國立臨床實驗室標準化委員會(National Committee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS)推薦的藥物敏感試驗(Antimicrobical Susceptibilitory Testing)液體稀釋法測定了KSL對變異鏈球菌標準菌株及實驗菌株的MIC及MBC值，結(jié)果顯示KSL對S.mutansATCC 25175及臨床菌株的MIC相同，MBC臨床菌株高于標準株。

通過觀察KSL對變異鏈球菌生長的殺菌曲線發(fā)現(xiàn)，陰性對照組在這4 h之內(nèi)細菌的數(shù)量變化不明顯，0.1%洗必泰陽性對照組在10 min后完全殺滅細菌。2×MIC濃度的KSL，在5 min內(nèi)就能夠減少S.mutans標準株及臨床株的數(shù)量，20 min后可達到殺菌效果，30 min之后基本上可完全殺滅細菌，且在4 h之內(nèi)無細菌生長。說明KSL能在較短時間內(nèi)殺滅變異鏈球菌，同時提示KSL可能具有抗生素后效應(yīng)，即細菌與抗生素或抗菌藥物，經(jīng)短時間接觸，將殘留抗生素清除后，細菌生長仍受抑制的生物現(xiàn)象。這也表明，可將KSL用于口內(nèi)局部用藥，通過短時間的藥物解除后能持續(xù)抑制變異鏈球菌生長，從而達到抑齲目的。從KSL對變異鏈球菌標準菌株及臨床株的殺菌曲線中可以看出，KSL對標準株的抑殺效果優(yōu)于臨床菌株，這可能與臨床菌株較強的致齲性及自身結(jié)構(gòu)有關(guān)，下一步實驗將對臨床菌株的血清型及致齲基因等作進一步分析研究。

以往的研究結(jié)果表明，KSL的特性為具有陽離子殘基及親水性，表明它的抗菌機制可能主要為通過其雙親性α-螺旋結(jié)構(gòu)上正電荷與細菌細胞膜上負電荷之間的靜電吸引而結(jié)合聚集在質(zhì)膜上，打亂了質(zhì)膜上蛋白質(zhì)和脂質(zhì)原有的排列秩序，從而導(dǎo)致細胞膜結(jié)構(gòu)紊亂，達到殺滅細菌的目的。但是其確切的抑菌機制尚不清楚，尤其是對標準株及臨床株的抑殺效果尚有不同，下一步研究的重點是研究其對高齲患者口內(nèi)變異鏈球菌的抑菌機制，檢測KSL作為一種潛在的抗口腔微生物制劑的臨床實用性。

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