腺病毒及其研究進展

陳娜娜,向冬喜,鄭叢龍

(大連大學醫學院 病原生物學教研室，遼寧 大連 116622)

腺病毒(Adenovirus) 是從手術切除的扁桃體組織分離培養得到的一種DNA病毒，主要在細胞核內繁殖，常引起人上呼吸道和眼部上皮細胞感染。腺病毒作為普通的機會性病原體長期存在于人群中，免疫功能低下的病人感染腺病毒的機率較大，在居住密集的人群，如軍隊人員中可引起急性發熱性呼吸道疾病的暴發流行[1]。隨著免疫學、分子生物學、分子病毒學等各個學科的發展和相互滲透，腺病毒在分子水平上的應用越來越廣泛，特別是有關腺病毒的感染、致病、抗腺病毒的治療和腺病毒載體的應用已成為研究的熱點。因腺病毒結構簡單,宿主范圍廣,感染率高,易于培養和純化，使腺病毒作為載體的基因治療迅速發展。本文就腺病毒及其相關研究進展做一綜述。

1 腺病毒的特征

1.1 腺病毒的分類

根據宿主范圍不同，腺病毒分為哺乳動物腺病毒屬(Mastadenovirus)和禽類腺病毒屬(Aviadenovirus)。人腺病毒(Human adenoviruses,HAdV)屬于腺病毒科(Adenoviridae)，根據免疫學、生物學、生物化學特性不同，將其分為 A～G 7個亞種，共有52個血清型[2],不同的血清型有不同的器官親和性并引起相應的臨床表現。

1.2 腺病毒的結構

腺病毒呈無囊膜的球形結構,其病毒粒子在感染的細胞核內常呈晶格狀排列，每個病毒顆粒包含一個36 kb的線性雙鏈DNA，兩端各有一個100～600 bp的反向末端重復序列(inverted terminal repeat,ITR),ITR的內側為病毒包裝信號，是病毒包裝所需要的順式作用元件。基因組包含早期表達的與腺病毒復制相關的E1～E4基因和晚期表達的與腺病毒顆粒組裝相關的L1～L5基因。線狀雙股DNA與核心蛋白形成直徑為60～65 nm的髓芯,被包裹于衣殼內。衣殼呈二十面體對稱，由252個直徑8～10 nm的殼粒組成,殼粒排列在三角形的面上,每邊6個,其中240個為六鄰體(非頂點殼粒) ,另12個為五鄰體基底(頂點殼粒)。每個六鄰體是六鄰體蛋白的同源三聚體,三聚體的六鄰體分子有一個三角形的塔尖和五面體的基底,塔區由4個環構成即loop1、loop2、loop3、loop4，基底包含兩個區域P1、P2區[3]。六鄰體上的表位(epitope)是診斷不同血清型的標準，它包括哺乳動物腺病毒屬的抗原成分，是病毒體對免疫選擇壓力最敏感的部位。每個五鄰體基底上結合著1根(哺乳動物腺病毒)或2根(禽腺病毒)長9～77.5 nm的纖維突起,這些纖維以五鄰體蛋白為基底由衣殼面伸出,纖維頂端形成頭節區，纖突有血清特異性，且含有負責體外血細胞凝集的種屬特異性抗原決定位點。

1.3 腺病毒受體

腺病毒除B和D亞種外，其它亞種的受體都是柯薩奇-腺病毒受體[4]。柯薩奇-腺病毒受體(Coxsackic-adenovirus receptor,CAR)又稱為Hela細胞膜結合蛋白，是柯薩奇病毒與腺病毒的特異性受體,其本質是一種細胞間黏附分子,在上皮細胞的緊密連接和細胞間相互連接處表達,CAR是相對分子量為46000的跨膜糖蛋白,該蛋白貫通細胞膜,分為胞外區、跨膜區、胞內區。CAR表達水平在介導腺病毒感染方面起著重要作用,其表達在體內是可調節的,具有階段依賴性，CAR受體表達越高,提示組織器官越容易感染。B亞種中大多數可與胞膜表面免疫調節分子CD46相結合，但ADV3和ADV7分別與相關免疫分子CD80或CD86結合。D亞種可與細胞表面普遍存在的唾液酸受體結合[5]。另一種參與腺病毒感染細胞的介質是細胞表面的第二受體整合素，包括αγβ3和αγβ5，它與五鄰體的基底部相結合[6]，整合素在細胞表面的表達水平高低,也影響了腺病毒的感染效率。

2 腺病毒的感染與致病性

2.1 腺病毒的感染

2.1.1 腺病毒引起感染的類型：腺病毒侵入宿主細胞后至少能引起3種感染:①慢性、潛伏性感染:常在淋巴細胞內發生，潛伏感染時外放的病毒量極少,細胞壞死也不明顯,故臨床上感染不明顯,潛伏感染的機制尚不清楚。②溶解性感染:病毒在細胞內如人類上皮細胞中經歷復制過程,通過溶解細胞作用使細胞死亡。③腫瘤樣變異：此時病毒繁殖只進行最初幾步,然后腺病毒DNA與細胞DNA整合并復制,但不產生感染性病毒,腺病毒抗原性較穩定。

2.1.2 腺病毒流行病學：腺病毒可通過人、水、媒介物和器械傳播，室溫條件下，腺病毒在污物中存在周期可延長至3周。腺病毒在兒童和軍營人員中更易發生感染和大規模流行，大多數嬰幼兒在出生后的5年內至少感染過1種腺病毒株[7]。在過去的幾年中，腺病毒作為主要的病原體在免疫功能低下宿主如艾滋病人、免疫遺傳缺陷的患者、骨髓接受者、固體器官和造血干細胞移植者常引起高發病率和死亡率；兒科經受同種型干細胞移植的病人，其感染腺病毒后死亡率可高達60%[8]。一些致命的感染常由腺病毒血清型1、2、3引起，在這些病人體內常會出現細菌、真菌等微生物共感染的情況。艾滋病人感染腺病毒會產生肺炎、肝炎、腦膜軟化、腎炎、胃腸炎等并發癥。

2.2 腺病毒的致病性

2.2.1 腺病毒所致疾病：腺病毒是無包膜病毒，在低pH值環境下可穩定存在，有很強的耐物理和化學試劑的作用，腺病毒可對胃腸分泌物和膽汁產生耐受，因此腺病毒可在胃腸內復制，產生很高的病毒載量。腺病毒常在咽、結膜、腸道及淋巴組織內繁殖，并導致各種各樣的臨床癥狀，比如呼吸系統的感染、結膜炎、胃腸炎、肝炎、出血性膀胱炎、神經系統的紊亂等。不同的腺病毒亞種會引起不同的疾病，如人腺病毒C亞種主要引起小兒科的上呼吸道感染,人腺病毒B亞種常在成年人中引起流行，人腺病毒B和E亞種是軍營人員感染的主要病因,人腺病毒F亞種會引起感染性腹瀉[9]。腺病毒在有免疫力的宿主體內感染是溫和的,而且具有自限性。

2.2.2 腺病毒致病機理：對腺病毒感染宿主細胞后引起疾病的致病機制尚不清楚，可能通過以下機制來逃避宿主的免疫應答：①通過與MHC-I類分子結合形成復合物來抑制末端氨基酸的糖基化或通過阻斷MHC-I類分子的轉錄或mRNA的轉運而阻止細胞表面MHC-I類分子受體的表達。②通過與病毒相關的RNA和E1A來抑制干擾素對腺病毒的作用。③腺病毒E1B基因編碼的蛋白可能通過與Bcl-2家族的促凋亡蛋白形成異源復合物來抑制感染細胞的內在凋亡。

在腺病毒持續感染過程中，蛋白14.7 kDa和gp19起重要作用，14.7 kDa蛋白與控制宿主免疫反應有關，可以阻斷腫瘤壞死因子介導的溶細胞作用；gp19阻止MHC-I類分子轉運到感染的細胞表面，減少細胞毒性T細胞對感染細胞的攻擊[10]。腺病毒通過感染樹突狀細胞(dendritic cells，DC)產生早期和晚期抗原來改變細胞表面標志，腺病毒還可通過感染單核細胞來抑制其分化為DC，從而逃避T細胞的識別[11]。在腺病毒急性感染恢復當中，T細胞介導的細胞免疫是很重要的，T細胞功能低下的病人感染腺病毒的幾率非常高。Mistchenko等[12]研究顯示，TNF-α、IL-6、IFN-γ在致命的腺病毒感染的兒童血清中含量高，而在輕度腺病毒感染者體內存在水平很低。體液免疫在腺病毒感染的免疫應答中亦起重要作用，有腺病毒血癥的HSCT(造血干細胞移植)接受者，在免疫應答清除病毒的過程中會產生高水平的血清特異性抗體[13]。

3 腺病毒的檢測方法

對腺病毒的檢測依賴于疾病的類型和所獲取的標本，確診腺病毒的存在可采用病毒的細胞培養、抗原測定和基因組檢測等技術。

3.1 細胞培養

常用A549、Hep-2和Hela細胞來培養臨床標本中的腺病毒。除血清型40和41外，其它腺病毒血清型在人上皮細胞系上生長良好，會導致細胞圓縮,出現核內包涵體聚集成串等病變現象，細胞病變2～7 d可見，可持續到28 d。盡管細胞培養仍然是金標準，但對臨床標本仍是不敏感，且比較慢，易受細菌和真菌的污染。

3.2 抗原檢測

常用來直接檢測腺病毒在呼吸道和胃腸道的感染，較快速且靈敏度較高。免疫熒光(尤其對呼吸道標本、咽拭子和活組織標本)和酶免疫分析(尤其對于糞便標本)是常用的方法，與細胞培養相比，免疫熒光所測腺病毒的靈敏性能提高40%～60%[14]，其它直接測定抗原的方法包括免疫層析法和乳膠凝集法。研究證實，與細胞培養檢測方法相比，使用免疫層析試劑盒所測定的靈敏度可達90%[15]。

3.3 電子顯微鏡

腺病毒的形態學特征決定其可用電子顯微鏡進行鑒別，但這種方法主要在一些機構使用，依據糞便中存在的病毒顆粒(大約106～108個/mL)，常用來診斷急性胃腸炎。

3.4 組織病理學

依據肺的組織病理學特征可對腺病毒引起的肺炎加以鑒別，肺的組織病理學特征包括彌散性肺炎、支氣管上皮細胞的壞死、單核細胞侵潤的毛細支氣管炎和透明膜的形成等，通過原位雜交、免疫組化和PCR可進一步進行鑒定。

3.5 分子生物學

用來檢測腺病毒基因組很靈敏，當病人體內病毒載量較低或需要快速的檢驗結果時更為適用。最近幾年分子生物學的方法在臨床運用越來越多,常選擇與六鄰體基因、纖突基因或病毒相關的RNA I和II作為PCR引物，PCR方法包括常規的PCR、Real Time-PCR，常規的PCR是一種定量分析的方法，需要1～2 d的時間，而Real Time-PCR可以在數小時內定量分析出結果。Lawrence等[16]應用的PCR和電噴霧電離質譜法相結合技術可對人腺病毒的血清型進行快速檢測和鑒定。

3.6 序列測定

德國Madischiw等[17]結合了普通PCR或者定量PCR與測序相結合技術,發明了一種兩步診斷法。測序是對核酸序列最全面、直觀的反映。隨著下一代測序技術的發展,測序速度得到了質的提升。因此，未來將測序應用于診斷也是一種趨勢。

4 抗腺病毒治療

藥物抗腺病毒機制可能有以下幾種：①藥物與腺病毒表面特定部位結合，在病毒吸附細胞的過程中，藥物可能會破壞腺病毒的纖突,阻止了病毒的吸附,使病毒不能進入細胞內復制。②藥物與細胞表面受體結合，改變細胞構象，使對腺病毒敏感的細胞變為非敏感細胞，從而改變細胞膜上病毒的數量和結構來控制病毒的感染。③藥物的某些成分進入細胞內，對胞內基因的代謝和表達起調節作用，從而抑制病毒核酸復制或阻止病毒蛋白合成。

目前,沒有正式的藥物用于抗腺病毒感染的治療，只有幾種抗病毒藥物如更昔洛韋，阿糖腺苷，病毒唑，西多福韋等用于一些病例和群體的研究[18]。楚建平等[19]通過體外試驗初步觀察到，更昔洛韋雖然不能直接滅活AdV3和阻止AdV3吸附至敏感細胞,但它具有抑制AdV3復制的作用,其作用明顯優于病毒唑。病毒唑是一種嘌呤核苷酸類似物，在體外能抑制DNA和RNA病毒，其作用機制可能是抑制RNA的加帽活動或直接抑制病毒多聚酶的作用或增加新合成DNA的基因突變[20]，其副作用主要是引起溫和可逆的鐮狀細胞貧血,利用病毒唑治療處于傳播腺病毒高發期的病人，效果不明顯。西多福韋是新型的胞嘧啶核苷膦酰基甲醚衍生物，是一種廣譜抗病毒藥物，在體外能抑制幾種DNA病毒的復制，在感染的細胞內通過形成二磷酸核苷類似物,與正常的核苷競爭性整合入病毒DNA,最終導致核酸鏈的延伸終止。盡管其有腎毒性、骨髓抑制、眼色素膜炎等副作用，但西多福韋快速治療腺病毒感染成功的幾率很高[21]。

5 腺病毒作為載體的應用前景

5.1 腺病毒載體的特性

腺病毒載體是黏膜免疫的理想載體，經口、鼻、氣管等黏膜表面接種,可獲得包括黏膜免疫、體液免疫和細胞免疫在內的全面免疫。腺病毒載體易于操作構建，能有效地將外源基因轉染到各種靶細胞或組織中，且能高效表達外源基因，尤其是以腺病毒為載體構建的重組活疫苗在進行癌癥、遺傳病和重要傳染病的基因治療等方面的研究應用最為熱門。

5.2 腺病毒載體優缺點及應用

腺病毒載體生產工藝簡便、制備純化相對容易、產毒滴度高、外源基因容量大(7～8 kb)，腺病毒載體攜帶的外源基因獨立于靶細胞染色體之外表達，無插入突變激活癌基因的危險，這使得腺病毒成為表達和傳遞治療基因的主要候選者[22]。由于腺病毒載體可以實現治療基因短暫的高表達，因此它在癌癥基因治療中具有無可比擬的優勢，涉及腺病毒基因轉移的腫瘤治療方案有很多，如利用病毒或非病毒載體向機體導入免疫調節蛋白及腫瘤特異性抗原來誘導抗腫瘤細胞免疫,以達到限制腫瘤生長,促使腫瘤消退的目的。腺病毒載體還被用于轉移IL-2、GM-CSF等細胞因子和p53等抑癌基因，治療的腫瘤包括神經膠質細胞瘤，頭頸部腫瘤等[23]。腺病毒載體能誘導機體對轉基因產物產生體液和細胞免疫應答的能力，因此被用作疫苗載體。Susan等[24]研究發現,L4-22K 和L4 - 33K作為啟動子來控制HAd5V的晚期階段的感染，這為腺病毒載體的應用提供了新的表達模式，重組的腺病毒載體HAd5V(Human Adenovirus 5)為激活淋巴細胞抗腫瘤和抗病毒作用提供了一個很好的平臺。不足的是，一些優先暴露感染HAdV的受試者，在接種HIV-HAd5V載體構建的疫苗后，會增加對HIV的易感性[25]，同時由于對AdV5有免疫力人群的普遍存在，可能會限制腺病毒載體的應用[26]。Shaoning Jiang等[27]研究顯示，重組腺病毒載體會減弱肝臟上胰島素信號分子的表達，最終導致體內糖代謝的改變，因此在應用腺病毒載體進行基因治療和研究時應予以考慮。針對腺病毒載體存在的表達時間短、免疫原性強，易引起炎癥反應和系統毒性等特點,最新研究的復制型腺病毒載體、低抗原性腺病毒載體和靶向腺病毒載體具有良好的應用前景。

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