P57KIP2和PCNA在胃癌組織中的表達(dá)及意義

盧書(shū)明，張竹青，劉麗娜，王朝暉，李 梅，呂 申

研究發(fā)現(xiàn)眾多癌基因、抑癌基因改變及細(xì)胞生命活動(dòng)異常最終都匯聚到細(xì)胞周期的調(diào)控上來(lái)。細(xì)胞周期調(diào)控異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，腫瘤被認(rèn)為可能是一種細(xì)胞周期疾病[1]。P57KIP2蛋白與細(xì)胞周期依賴(lài)激酶復(fù)合物(CDKs)結(jié)合抑制CDKs的功能，使細(xì)胞周期停滯于G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是細(xì)胞周期正向調(diào)控因子，它可促使細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換，是反映細(xì)胞增殖活性的良好指標(biāo)。本研究應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)P57KIP2和PCNA蛋白在胃癌及非癌胃黏膜中的表達(dá)，旨在探討兩者在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 病例資料

收集大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2008年10月～2009年8月因上消化道癥狀行胃鏡檢查的胃癌及非癌胃黏膜共105例。其中，胃癌57例，非癌胃黏膜組48例，均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)。胃癌組男性42例，女性15例，年齡37歲～85歲，平均年齡64.07歲。其中，高中分化腺癌14例，低分化腺癌34例，粘液癌9例。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟1987年公布的胃癌TNM臨床病理分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期。所有對(duì)象受檢前均未經(jīng)放療、化療等治療。非癌胃黏膜組男性34例，女性14例，年齡41歲～85歲，平均年齡64.10歲。標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，分別做HE、SP免疫組化染色。

1.2 方 法

HE染色切片用于胃癌分化程度的判斷。SP免疫組化染色按試劑盒說(shuō)明操作，組織抗原經(jīng)微波修復(fù)。抗P57KIP2兔抗人多克隆抗體(RAB-1017)、S-P試劑盒及DAB顯色劑試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司；抗PCNA鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自NEMARER公司。用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

P57KIP2蛋白以細(xì)胞核或胞漿染色呈棕黃色為陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞。PCNA以細(xì)胞核染色呈棕黃色視為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片在400倍鏡下均觀察整體染色情況，選擇5個(gè)有代表性的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域計(jì)算200個(gè)細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：陽(yáng)性數(shù)<5%為0；陽(yáng)性數(shù)>5%，但≤35%為1；陽(yáng)性數(shù)>35%，但≤70%為2；陽(yáng)性數(shù)>70%為3。著色強(qiáng)度計(jì)分：不著色為0，弱著色(呈淡棕黃色)為1，強(qiáng)著色(呈明顯的棕黃色)為2。陽(yáng)性分級(jí)：以上兩項(xiàng)相加，0分為(-)，2分為(±)，3分為(+)，4分為(++)，5分為(+++)：+～+++計(jì)為陽(yáng)性，-～±計(jì)為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5軟件中χ2檢驗(yàn)、確切概率法統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 P57KIP2蛋白、PCNA在胃癌組織及非癌胃黏膜中的表達(dá)情況

P57KIP2蛋白在57例胃癌組織中有25例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為43.9%，48例非癌胃黏膜組織中38例表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為79.2%，兩者相比差異有顯著性意義(χ2=10.65，P<0.05)。在57例胃癌組織中有46例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為80.7%，48例非癌胃黏膜組織中28例表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為58.3%，兩者相比差異有顯著性意義(χ2=6.30，P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1～4。

2.2 P57KIP2蛋白、PCNA與臨床及病理特征的關(guān)系

P57KIP2蛋白在高中分化腺癌、低分化腺癌、粘液癌組中陽(yáng)性表達(dá)率分別為71.4%、32.4%、44.4%，高中分化腺癌組P57KIP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于低分化腺癌組，兩者相比差異有顯著性意義(P<0.05)，而高中分化腺癌組與粘液癌組P57KIP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組P57KIP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為41.4%、50%，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期與臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期的P57KIP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為41.1%、50%，兩組組間比較差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)；浸潤(rùn)深度未累及漿膜者與累及或穿透漿膜P57KIP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為33.3%、46.6%，腫瘤≥5 cm與腫瘤<5 cm組P57KIP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為54.1%、36.6%，兩組組間比較差異均無(wú)顯著性意義(P>0.05)。結(jié)果提示，P57KIP2蛋白表達(dá)與胃癌分化程度呈正相關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、臨床分期、腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性。見(jiàn)表2。

表1 P57KIP2、PCNA在胃癌組織及非癌胃黏膜中的表達(dá)Tab 1 The expression of P57KIP2,PCNA in gastric carcinoma and peri-carcinoma gastric tissues (n)

1)與非癌胃黏膜相比P<0.05

圖1 P57KIP2在非癌胃黏膜的表達(dá) (SP×400)Fig 1 P57KIP2 immunohistochemistry staining in peri-carcinoma gastric tissue (SP×400)

圖3 PCNA在非癌胃黏膜的表達(dá) (SP×400)Fig 3 PCNA immunohistochemistry staining in peri-carcinoma gastric tissue (SP ×400)

圖2 P57KIP2在胃癌黏膜表達(dá)明顯降低 (SP×400)Fig 2 P57KIP2 immunohistochemistry staining in gastric carcinoma tissue is increased obviously (SP ×400)

圖4 PCNA在胃癌黏膜中表達(dá)明顯增強(qiáng) (SP×400)Fig 4 PCNA immunohistochemistry staining in peri-carcinoma gastric tissue is increased obviously (SP ×400)

PCNA在高中分化腺癌、低分化腺癌、粘液癌組中陽(yáng)性表達(dá)率分別為57.1%、88.2%、88.8%，高中分化腺癌組PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于低分化腺癌組，差異有顯著性意義(P<0.05)，高中分化腺癌組與粘液癌組比較差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PCNA陽(yáng)性表達(dá)率為82.9%高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的75%，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期PCNA的陽(yáng)性表達(dá)率為82.1%,高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期的77.8%,浸潤(rùn)深度未累及漿膜組PCNA陽(yáng)性表達(dá)率為83.3%,高于累及或穿透漿膜組的80.0%，但三組組間比較差異均無(wú)顯著性意義(P>0.05)；腫瘤≥5 cm組與腫瘤<5 cm組PCNA陽(yáng)性表達(dá)率分別為79.2%、81.8%，兩者相比差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。結(jié)果提示,PCNA表達(dá)與胃癌組織分化程度呈負(fù)相關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、臨床分期、腫瘤大小無(wú)顯著相關(guān)性。見(jiàn)表2。

3 討 論

真核生物細(xì)胞周期的調(diào)控是由一系列細(xì)胞周期調(diào)控因子參與的復(fù)雜過(guò)程。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)異常是細(xì)胞過(guò)度增殖及癌變的重要原因[2]。調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的核心是細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶(CDKs)，細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)可與之結(jié)合形成有活性的復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，而細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶抑制劑(CKIs)與CDK結(jié)合后抑制CDK-Cyclin復(fù)合物功能，使細(xì)胞周期停滯，阻止細(xì)胞增殖。根據(jù)CKIs的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，分為INK4家族和CIP/KIP家族。p57KIP2基因定位于11p15.5染色體，其功能與p21、p27相同，是一種抑癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物P57KIP2蛋白是細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，屬于CIP/KIP家族[3,4]。P57KIP2蛋白主要通過(guò)抑制CDK復(fù)合物的功能，使細(xì)胞不能順利進(jìn)入S期，而停止于G1期，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控作用。

表2 P57KIP2蛋白、PCNA與臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 The relation of P57KIP2,PCNA with the clinical pathological parameters (n)

1)與低分化相比,P<0.05

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)包括肝癌、胰腺癌等多種腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)[5-8]，P57KIP2表達(dá)下降與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及分化相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，P57KIP2蛋白在胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于非癌胃黏膜組(P<0.05)，表明在胃癌組織中存在明顯的P57KIP2蛋白表達(dá)下降，提示P57KIP2蛋白的低表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)。這與Shin等人的報(bào)道一致[9]。在胃癌發(fā)生過(guò)程中可能由于p57KIP2基因的失活導(dǎo)致其蛋白表達(dá)缺失，從而使細(xì)胞惡性增殖。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高分化組P57KIP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于低分化組(P<0.05)，表明P57KIP2蛋白與胃癌的分化程度有關(guān)，即胃癌分化越低，P57KIP2蛋白表達(dá)越少。而Reid 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，P57KIP2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞絕大部分為終末期分化細(xì)胞，說(shuō)明P57KIP2蛋白在細(xì)胞增殖及分化中有重要作用，P57KIP2可能參與了癌細(xì)胞分化的過(guò)程，并在細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化的過(guò)程中起了調(diào)節(jié)作用。P57KIP2蛋白表達(dá)下調(diào)，可能使得腫瘤細(xì)胞失去了有效抑制，從而引起腫瘤的惡性進(jìn)展。因此，若能恢復(fù)P57KIP2蛋白的正常表達(dá)，可能會(huì)抑制腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，可為腫瘤的治療提供新的途徑和思路。國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道[11]，P57KIP2蛋白表達(dá)下降與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，推測(cè)P57KIP2蛋白低表達(dá)可能在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期組的P57KIP2蛋白表達(dá)低于未發(fā)生轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期者，但差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)，有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

PCNA是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，與DNA合成有密切關(guān)系，主要存在于細(xì)胞周期的G1期和S期，是反映細(xì)胞增殖活性的重要生物學(xué)指標(biāo)。PCNA與惡性腫瘤的增長(zhǎng)活性、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切關(guān)系，是評(píng)價(jià)惡性腫瘤增殖活性和預(yù)后判斷的一個(gè)重要指標(biāo)[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胃癌組PCNA陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于非癌胃黏膜組，而且PCNA與胃癌的分化程度明顯相關(guān)，低分化及粘液癌組PCNA表達(dá)明顯高于高中分化組(P<0.05)。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期組PCNA表達(dá)高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期者，而統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)顯著相關(guān)性。以上結(jié)果提示，PCNA可客觀地反映胃癌組織的分化程度。胃癌分化越差，PCNA表達(dá)越強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞的增殖活性越高、腫瘤的惡性程度越高。

P57KIP2蛋白表達(dá)降低、PCNA表達(dá)增高參與胃癌的發(fā)生，聯(lián)合檢測(cè)P57KIP2、PCNA蛋白的表達(dá)有助于胃癌發(fā)生及惡性程度的判定。但P57KIP2蛋白在胃癌組織中表達(dá)降低的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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