卵磷脂對胎兒生長受限模型子鼠學習記憶力的影響

李巍巍，任麗娜

(中國醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110001)

胎兒生長受限(fetal growth restriction,FGR)發(fā)病率占妊娠的2．75%～15．53%不等，中國的發(fā)病率平均為6．39%[1],是圍生期的重要并發(fā)癥之一。Alberry等[2]經(jīng)過6年的隨訪追蹤發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GR患兒的生長參數(shù)、神經(jīng)發(fā)育評分及智商等均顯著低于對照組。因此預防和減少FGR的發(fā)生有重要意義，目前孕期營養(yǎng)不良與FGR的關系已越來越受到關注，除熱能和蛋白質不足外，維生素營養(yǎng)不足，如維生素A、維生素E、維生素B、葉酸等不足對胎兒宮內(nèi)生長的不良影響正逐漸引起人們的注意[3]。母體的健康與治療對FGR影響非常大，及時處理可改善FGR的預后[4]。卵磷脂具有增強組織和細胞結構，增強人體生理機能，改善脂肪代謝等功效[5]。本研究通過慢性宮內(nèi)乏氧模型探討卵磷脂攝入促進FGR子鼠神經(jīng)發(fā)育的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 大鼠FGR模型制備：無交配史大白鼠20只(由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供)受孕后隨機分為兩組：(1)對照組10只于妊娠第17天行腹部開關術；(2)FGR組10只于妊娠第17天行經(jīng)腹子宮動脈縮窄術。其余處理兩組相同，妊娠21～23 d分娩為足期分娩，其子鼠為本研究對象。

1.1.2 FGR子鼠判斷標準:用電子天平為子鼠稱重，精確到0.01 g,以低于對照組子鼠平均體重2個標準差為FGR判斷標準，并且廢除FGR組中不符合FGR診斷標準的子鼠，本實驗中子鼠均為FGR子鼠。

1.1.3 實驗分組：將篩選出的FGR子鼠隨機分為兩組,實驗組與對照組各10只。兩組均以標準小鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，實驗組子鼠額外灌食卵磷脂100 mg/d[6]。

1.2 學習記憶能力檢測

1.2.1 Morris水迷宮實驗：Morris水迷宮為一不銹鋼的圓形水池，內(nèi)壁黑色，直徑100 cm，高50 cm，水溫控制在(22±1)℃。水池等分為4個象限，任選其中1個象限，正中放置1個安全平臺。平臺為圓形，直徑10 cm，沒于水下1 cm。水池放在一間小屋的中央，室內(nèi)的門、窗、攝像頭等構成視覺暗示。迷宮上方安有攝像機，并和計算機連接，自動錄入小鼠游泳軌跡并進行分析。歷時5 d，上下午各1 次/d，入池位置為平臺所鄰2個象限的池壁中點。將小鼠面向池壁分別從入水點放入水中，記錄其在100 s內(nèi)尋找到平臺的時間(逃避潛伏期)。如果小鼠100 s未找到平臺，則由實驗者用手牽引其至平臺上，停留10 s，逃避潛伏期記成100 s。以2次/d潛伏期算術均值作為這一天的成績進行統(tǒng)計分析。

1.2.2 探索試驗：撤除平臺，任選1個入水點將小鼠放入水中，使小鼠在無平臺情況下尋找記憶中平臺，記錄其100 s游泳軌跡，計算其在原平臺象限游泳時間和穿越原平臺次數(shù)。

1.3 神經(jīng)元原位凋亡檢測

水迷宮、探索試驗后將實驗組子鼠及對照組子鼠斷頭取腦，稱重，4%多聚甲醛固定24 h。從海馬平面作厚約2 mm冠狀切片，常規(guī)石蠟包埋切片。采用末端脫氧核糖核酸轉移酶dUTP缺口末端標記法(Tdt-mediated dUTP nick end labeling TUNEL)。試劑盒購自瑞士Rocher 公司，參照說明書操作。結果判斷：陽性細胞為棕黃色。每個部位計數(shù)左右各3個高倍鏡(×400)視野下陽性細胞數(shù)，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 各組小鼠隱蔽平臺實驗結果比較

隱蔽平臺實驗從第1天起，實驗組的逃避潛伏期即明顯短于對照組(P<0．01)，見表1。

表1 各組小鼠隱蔽平臺實驗逃避潛伏期的比較Tab 1 Time to find platform in 2 groups (n=10)

2.2 各組小鼠探索實驗結果比較

撤除平臺后，觀察小鼠的空間探索能力，發(fā)現(xiàn)實驗組軌跡大部分位于原平臺象限，其次較多地在原平臺象限相鄰的左右兩側象限尋找。對照組基本圍繞池壁游泳，其運動軌跡呈隨機分布于各象限之中。由表2可以看出實驗組的停留原平臺象限時間和穿越原平臺次數(shù)均明顯多于對照組(P<0.01)，見表2。

表2 各組小鼠探索實驗的結果比較Tab 2 Result of Passive avoidance test in 2 groups (n=10)

1)與對照組比較，P<0.01

2.3 子鼠神經(jīng)元原位凋亡檢測

實驗組子鼠皮層神經(jīng)細胞的凋亡率平均為(2.2±0.58)個/HP,對照組為(5.08±1.21)個/HP，兩組差異有顯著性意義(P<0.01)；海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率：實驗組平均為(0.59±0.23)個/HP，對照組為(1.71±0.63)個/HP，兩組差異有顯著性意義(P<0.01)。見表3。

表3 兩組子鼠皮層及海馬CAI區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率比較Tab 3 Neuronal apoptosis in cortex and hippocampus in 2 groups (個/HP)

1)與對照組比較，P<0.01

3 討 論

3.1 FGR與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育

FGR是指任何原因胎兒在宮內(nèi)生長速度受限，體重低于該孕周標準值第10百分位數(shù)以下。發(fā)生率約2.75%～15.53%[7]。迄今為止胎兒生長受限的病因尚未完全闡明，目前認為它是多種因素作用的結果，其病因學包括環(huán)境因素和遺傳因素。最直接的原因是胎盤發(fā)育異常和循環(huán)功能障礙。研究表明，F(xiàn)GR患者的胎盤血管床阻力增加，導致胎盤胎兒血流灌注量減少，限制營養(yǎng)物質攝取和轉運，胎兒生長受限，甚至導致新生兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲滯。據(jù)報道，F(xiàn)GR新生兒神經(jīng)功能異常發(fā)生率為32%[8]。因此推測FGR胎兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷可能與胎盤功能不全導致的慢性宮內(nèi)缺血缺氧有關。本研究通過結扎子宮動脈制造缺血性FGR模型，通過水迷宮實驗等探討子鼠學習記憶力，以及通過攝取富含磷脂酰膽堿的卵磷脂，探討改善FGR子鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷的可能性。

學習記憶是大腦的高級神經(jīng)生理活動。水迷宮是英國心理學家Morrisr于20世紀80年代初設計的[9]。大鼠在多次的訓練中，學會尋找固定位置的隱蔽平臺，形成穩(wěn)定的空間位置認知，這種空間認知是加工空間信息(外部線索)形成的，近年來已發(fā)展成為廣泛應用的標準的空間學習記憶檢測方法[10]。定位航行試驗潛伏期的長短反映動物空間記憶的獲得情況，即學習能力。空間探索試驗主要反映動物的記憶能力和空間定位能力。而檢測藥物干預后動物的學習記憶能力是判斷藥物療效的重要指標之一。本研究顯示，通過攝入卵磷脂，實驗組子鼠皮層神經(jīng)細胞的凋亡率平均為(2.2±0.58)個/HP,對照組為(5.08±1.21)個/HP；海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率：實驗組平均為(0.59±0.23)個/HP,對照組為(1.71±0.63)個/HP，實驗組與對照組比較，皮層及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡差異有顯著性意義(P<0.01)，實驗組子鼠空間學習記憶能力較對照組明顯上升(P<0.01)。海馬區(qū)與學習記憶功能密切相關，F(xiàn)GR子鼠皮層、海馬神經(jīng)元凋亡率明顯高于正常FGR子鼠，本研究顯示攝入卵磷脂有助于改善子鼠皮層、海馬神經(jīng)元凋亡從而改善FGR子鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷，有助于提高日后學習記憶能力。

3.2 FGR的長遠影響

據(jù)報道，F(xiàn)GR新生兒智力和精神運動障礙發(fā)生率較正常兒明顯增加[7]。Geva等[11]對123例FGR和正常兒童進行了為期9年的隨訪，發(fā)現(xiàn)FGR組兒童智商、學習成績、學習記憶、語言、創(chuàng)造性等能力均比正常組兒童明顯降低。FGR患者生長及智力發(fā)育緩慢、滯后。成年后是發(fā)生內(nèi)分泌代謝障礙、心血管疾病、阻塞性肺疾病、腎臟疾病和內(nèi)分泌代謝障礙等疾病的高危人群。因此，及早發(fā)現(xiàn)、及早干預FGR對兒童生長發(fā)育有深遠的意義。如何改善FGR胎兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷，提高日后學習記憶能力，日益為眾多學者所關注。卵磷脂修復受損腦細胞，改善腦部血液循環(huán)同時維持腦神經(jīng)細胞功能，加快神經(jīng)傳導。卵磷脂為大豆油生產(chǎn)的副產(chǎn)品，來源廣泛，其獨特的生理功能為人們所認識，作為食品可為人們所攝取。本研究通過補充卵磷脂改善FGR子鼠缺血性腦損傷，正是基于卵磷脂所含有的磷脂酰膽堿作為神經(jīng)遞質對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有重要作用，為探尋通過早期營養(yǎng)干預改善FGR新生兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育提供思路。

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