頭頸部鱗狀細胞癌細胞系染色體核型的檢測和分析

呂 梅，徐爾東，杜翠萍，姚藝文，翟立杰

(大連醫科大學 附屬第一醫院 耳鼻咽喉科，遼寧 大連 116011)

頭頸部腫瘤是國際上發病率最高的癌癥之一。據WHO統計，其發生率位居世界第6位，在亞洲國家發生率最高，在北歐相對較低。而95%頭頸部惡性腫瘤來源于上皮層，即鱗狀細胞癌。它們主要分布于1)上呼吸道，包括鼻腔、副鼻竇、鼻咽部及喉部；2)口腔和下咽部。其他頭頸部的惡性腫瘤則主要來源于大、小涎腺[1]。由于組織病理學的一致性，人們往往一起研究及總結這些腫瘤的遺傳學規律。

有關頭頸部鱗狀上皮細胞癌的細胞遺傳學研究表明，其染色體畸變的類型不同于像血液腫瘤所表現的簡單、特異性、平衡性的染色體重排；主要表現為復雜、多倍體的、非平衡性的染色體重排，然而其畸變的規律卻是非任意性的[2]。本實驗對18個來源于頭頸部不同位置的鱗狀細胞癌細胞系進行細胞培養，收集分裂中期細胞，進行染色體“G”帶染色，分析核型，并與以往的研究結果進行對照總結，進一步探討頭頸部鱗狀細胞癌的染色體變異規律。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

18例頭頸部鱗狀細胞癌細胞系(來源于鼻腔、鼻竇5例，鼻咽部3例，口腔部4例，喉部6例)由香港大學解剖教研室Sai-Wah Tsao教授贈給。

2例下鼻甲黏膜上皮(來自鼻整形病人)，1例鼻咽部黏膜上皮(來自鼻咽癌患者正常側活檢)，1例癌旁組織(來自喉癌患者)短期傳代(≤4代)細胞培養作為陰性對照，臨床標本均來自大連醫科大學附屬一院。

1.2 細胞培養

頭頸部鱗狀細胞癌細胞系在RPMI 1640培養液(含10%小牛血清，100 IU/mL青霉素，0.2 mg/mL鏈霉素和2.5 μg/mL二性霉素)中培養。正常對照上皮組織剪碎后，經180 U/mL膠原酶Ⅱ，37 ℃孵育過夜；然后放入膠原包被的培養瓶中培養。其培養液為角化細胞培養液(含0.23 mg/mL的L-谷酰胺，100 IU/mL青霉素，0.2 mg/mL鏈霉素，和2.5 μg/mL二性霉素)。細胞大體生長狀態是在倒置顯微鏡下觀察。

1.3 分裂中期細胞染色體“G”帶染色

培養細胞在收獲之前，培養液中加入秋水仙堿(0.01 μg/mL)作用12 h，0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化細胞脫壁。0.06 M KCl低滲處理細胞35 min，再由固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)固定。將3～4滴細胞懸液滴于一張浸于4 ℃水中備用載玻片上，60 ℃烘烤過夜。然后將玻片浸于2×SSC中，60 ℃作用3 h。最后賴特氏染液(BDH Burr)作用1 min 30 s。

1.4 細胞染色體核型分析

100倍光學顯微鏡下找到分裂中期細胞，拍攝分散的染色體。利用細胞遺傳學影像分析軟件(Newcatlte,UK)編排染色體，根據國際人類細胞遺傳學命名法(ISCN1995)標準描述細胞染色體核型。

2 結 果

4例對照組上皮細胞均表現為人正常染色體核型(圖1)。18例頭頸部鱗狀細胞癌細胞系核型主要表現為大量復雜的、不平衡性結構重排和染色體數目的改變(圖2)。但這種畸變并不是隨機的，而是有規律可循的。

2.1 染色體成分/數目的改變

與每個細胞系染色體所接近的整倍體數目比較，主要表現為染色體成分/數目的丟失(15例，83%)。

2.2 染色體/臂成分的失衡

染色體/臂成分的丟失主要表現為：2q，3p，4，8p，9p，13，14，15，17，18，21，22；染色體/臂成分的增加主要表現為：3q，7，8q，11q13，20 (表1)。

表1 18例頭頸部鱗狀細胞癌細胞系染色體/臂成分的失衡主要表現Tab 1 Chromosomal imbalances in 18 cases of HNSCC cell lines

2.3 染色體斷裂點部位

大量的染色體斷裂點位于著絲粒區域,347個斷裂點中含位于中心體區域的斷裂點208個(58%)。本實驗斷裂點出現在著絲粒區域，即斷裂點出現在著絲粒帶p10和q10；或近著絲粒帶p11和q11，主要表現為等臂染色體形成，整條染色體臂的易位和丟失；常常涉及到的斷裂點主要有1p11-q11，3p11-q11，5p11-q11，7p11-q11，8p11-q11，14p11-q11 (表2)。

圖1 正常對照組細胞染色體為人正常有核細胞染色體核型(×1000)Fig 1 The cellular chromosomes of normal control group showed normal human chromosome karyotype(×1000)

90-101,XXXX,+X,del(X)(p11),del(1)(q31),+der(1)t(1;4)(q11;q11),der(3)t(1;3) (p13;q11) hsr(1;3)(p13;q11) ×2,-4,+6,+7,+7,+9,der(11) add(11) (q13) hsr(11)(q13),-13,-13,-14,?add(14)(q32),-18,-21,-22,mar1,mar2

圖2-1 喉鱗狀細胞癌
Fig 2-1 Laryngeal squamous cell carcinoma

71-81,XX,-Y,+2,t (2;16)(q33;q24),i(3)(q10) ×2,der(3)t(3;7)(p25;q11) ×2,-4,+ i(8)(q10) ×2,+9,+11,+dup(14)(q22q23),+15,+17,-18,+20,+21

圖2-2 舌鱗狀細胞
Fig 2-2 Glossal squamous cell carcinoma
圖2 HNSCC組具有代表性染色體畸變的核型(×1000)
Fig 2 The representative chromosomal karyotype of HNSCC cell lines(×1000)

表2 18例頭頸部鱗狀細胞癌細胞系染色體著絲粒區域斷裂點Tab 2 Chromosomal breakpoints at centromeric regions in 18 cases of HNSCC cell lines

3 討 論

腫瘤的發生、發展演變過程同時也是基因組不斷變化的積累過程。癌基因和抑癌基因是與腫瘤形成密切相關的兩類效應基因。癌基因的前體是原癌基因，原癌基因具有調控細胞正常生長和分化的能力。癌基因的激活主要是通過原癌基因的點突變、病毒插入、染色體異位及基因擴增等引起，并將導致細胞無限制的增殖。抑癌基因主要抑制細胞生長、促進細胞死亡。當抑癌基因在突變、缺失、部分或全部染色體丟失的情況下失活后，也會導致細胞的增殖[3]。因此，癌基因活化及抑癌基因失活的逐漸積累促進了腫瘤的惡性發展。而染色體增加、丟失、斷裂、重組的過程直接導致了基因組的變異。

在本實驗研究中發現頭頸部鱗狀細胞癌細胞內部分染色體成分擴增，部分染色體成分缺失。這實際上在基因量變上確定了癌基因的激活和擴增，抑癌基因的抑制及缺失。雖然某些機制尚不完全清楚，本文僅以以下已證實了的在頭頸部鱗狀細胞癌發生機制中起重要作用的基因變化，探討染色體改變、基因變異及腫瘤發生的辯證關系。

c-myc癌基因定位于染色體8q24帶。基因c-myc編碼的轉錄因子通過與生長調節因子內特異DNA序列結合而促進其表達，進而促進細胞的生長、分化。同時研究證明c-myc蛋白又可作用于端粒逆轉錄酶，促進其表達并增強其酶的活性，間接抑制細胞的衰老及死亡[4]。染色體8q增多，導致c-myc基因的擴增及其所編碼蛋白的過度表達，這對腫瘤的形成具有重要作用。大量研究報道8q增多/c-myc基因的擴增與頭頸部惡性腫瘤的轉移和復發具有明顯正相關性。

Hsr(均染區)作為染色體內基因擴增的細胞遺傳學標志在本研究中多次出現，并且經常定位于11q13。以往頭頸部腫瘤熒光原位雜交研究證實，許多非定位于11q13的hsr的基因序列來源于染色體11q13帶[5]。癌基因CCND1定位于11q13，CCND1作為一細胞周期調節蛋白，調節細胞周期從G1期過渡到S期[6]。過度表達CCND1可導致細胞周期G1期的縮短，縮短了基因檢測系統對錯誤DNA序列的修復時間，以致未修復異常基因的逐漸積累，以及帶有錯誤基因細胞的不斷分裂和擴增。

9p染色體片段的丟失是頭頸部磷狀細胞癌最常見的遺傳學改變之一?；騊16/CDKN2A定位于9p21-22區域。CDKN2A基因編碼G1細胞周期依賴激酶(Cdks)抑制劑，其通過與Cdks蛋白結合，及抑制pRB(視網膜母細胞瘤)蛋白磷酸化，延長細胞周期G1期基因檢測修復階段，阻止進入S期。CDKN2A基因失活必將導致細胞檢測系統及細胞增殖的失調[7]。

3P的缺失是頭頸部磷狀細胞癌染色體最早期改變之一。已發現定位于3p的抑癌基因為FHIT基因。其基因的變異和蛋白功能的失調常發現于早期的頭頸部磷狀細胞癌和癌前病變的研究中[8,9]。

視網膜母細胞瘤基因——RB基因在調節細胞周期以及細胞分化的過程中起關鍵的作用。該基因定位于染色體的13q。低磷酸化RB蛋白作為其活化形式，與轉錄因子E2F家族蛋白結合，發揮阻止轉錄因子DNA合成和促進細胞分裂的功能。G1晚期，RB蛋白被細胞周期依賴激酶磷酸化，釋放E2F轉錄因子，促使細胞進入S期[10]。染色體13q丟失、RB基因低表達與腫瘤的高惡性度和不良預后密切相關。

本實驗研究中，染色體丟失的機率明顯高于染色體成分、數目的增加，這說明抑癌基因的功能失調在頭頸部鱗狀細胞癌發生機制中起相對主要的作用。

另一方面，大量的染色體斷裂點出現在著絲粒區域是頭頸部鱗狀細胞癌的一特殊細胞遺傳學改變。一種可能的原因是該區域的基因在染色體斷裂時所引起的活化或缺失，是頭頸部鱗狀細胞癌腫瘤形成的致病因素之一。研究證明，近著絲粒區域的DNA在CpG島區的甲基化程度明顯高于其他區域的DNA。應用甲基轉移酶抑制劑5-氮胞甘可引起染色體著絲粒區域的斷裂，促進姐妹染色單體的互換、核內復制及染色體臂的易位[11]。因此，雖然染色體某些部位基因CpG島區的過度甲基化可以抑制某些抑癌基因的作用，但著絲粒區域基因的去甲基化又可促進染色體結構的不穩定性。

頭頸部鱗狀細胞癌細胞遺傳學的研究使大家認識到，頭頸部鱗狀細胞癌染色體畸變是非任意性的，是有一定規律可循的。染色體數目、結構的不斷變異可能造成癌基因擴增、活化，抑癌基因的抑制和缺失；這種多基因改變的不斷積累貫穿著腫瘤發生、發展的全部過程。對于頭頸部鱗狀細胞癌染色體畸變規律的研究和認識，將對頭頸部腫瘤的診斷、預后，以及指導臨床治療具有重要意義。

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