南京地區(qū)1 386株臨床分離酵母的鑒定及藥敏分析

李匯明，梅亞寧

1. 南京醫(yī)科大學(xué)診斷學(xué)教研室，南京 210029；2. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210029

隨著免疫抑制劑、廣譜抗菌藥物、動(dòng)靜脈置管和其他插管的廣泛使用及組織器官移植、化療手段在臨床的應(yīng)用，深部真菌感染病例不斷上升[1-3]，特別是假絲酵母(又稱念珠菌)感染已成為日益突出的問(wèn)題。為研究深部感染酵母的病原學(xué)特征及其對(duì)藥物的敏感性，本文對(duì)我院2008年1～12月臨床分離的1 386株酵母進(jìn)行鑒定及藥敏分析，以便為臨床更有效、合理地使用抗真菌藥物提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株

2008年1～12月從我院深部真菌感染的臨床標(biāo)本中分離到1 386株酵母，其中來(lái)源于下呼吸道痰標(biāo)本744株(53.68%)，尿液標(biāo)本211株(15.22%)，鼻咽拭子標(biāo)本137株(9.88%)，其他分泌物膿標(biāo)本95株(6.86%)，血液標(biāo)本78株(5.63%)，其他標(biāo)本121株(8.73%)。標(biāo)準(zhǔn)菌株、白假絲酵母ATCC 64548和白假絲酵母ATCC 64550由廣州迪景微生物科技有限公司提供。

1.2 試劑

沙保羅培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Oxod公司，CHROMagar Candida顯色培養(yǎng)基購(gòu)自鄭州博賽公司，Rosco Neo-Sensitabs抗真菌藥敏紙片(包括兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素、伏立康唑、5-氟胞嘧啶和克霉唑)購(gòu)自廣州迪景微生物科技有限公司。

1.3 菌株分離鑒定

菌株在CHROMagar Candida顯色培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落顏色可鑒定出白假絲酵母、熱帶假絲酵母、光滑假絲酵母和克柔假絲酵母。不能用顯色培養(yǎng)基鑒定的菌株，用沙保羅培養(yǎng)基35 ℃培養(yǎng)48 h，分離、純化，用API 20C AUX鑒定到種，仍不能鑒定到種的為其他假絲酵母。

1.4 藥敏試驗(yàn)

采用瓊脂擴(kuò)散法RPMI 1640培養(yǎng)基，即3-嗎啉丙磺酸加2%葡萄糖，再加入1.8%瓊脂，于無(wú)菌水中加熱溶解。調(diào)pH至7.0，15磅15 min高壓滅菌。45 ℃加入RPMI 1640培養(yǎng)液，混勻后傾注平板，厚度(4.0±0.5)mm，冷卻備用。用0.85%生理鹽水調(diào)菌液濃度為1×108cfu/ml，用無(wú)菌棉拭沾菌液，3個(gè)方向均勻涂于RPMI 1640培養(yǎng)基表面。將含藥片紙貼于平板表面(片距>25 mm)，35 ℃培養(yǎng)18～24 h，測(cè)量抑菌環(huán)，判讀結(jié)果。

1.5 藥物敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)Rosco Neo-Sensitabs抗真菌藥敏紙片的基本抑菌圈判讀標(biāo)準(zhǔn)，兩性霉素B、伊曲康唑、制霉菌素抑菌環(huán)直徑≥15 mm為敏感，10～14 mm為中介，<10 mm為耐藥；氟康唑、克霉唑、5-氟胞嘧啶抑菌環(huán)直徑≥20 mm為敏感，12～19 mm為中介，≤11 mm為耐藥；伏立康唑抑菌環(huán)直徑≥14 mm為敏感。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Whonet 5.4軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 真菌培養(yǎng)結(jié)果

2008年1～12月從疑為深部真菌感染的我院門(mén)診及住院患者4 845例標(biāo)本中共檢出1 386株酵母，其中白假絲酵母817株(58.95%)，熱帶假絲酵母221株(15.95%)，光滑假絲酵母210株(15.15%)，克柔假絲酵母38株(2.74%)，近光滑假絲酵母35株(2.53%)，葡萄牙假絲酵母22株(1.59%)，季也蒙假絲酵母5株(0.36%)，無(wú)名假絲酵母4株(0.29%)，都柏林假絲酵母2株(0.14%)，釀酒酵母2株(0.14%)，新生隱球菌2株(0.14%)，毛孢子菌2株(0.14%)，其他酵母26株(1.88%)(表1)。患者年齡21～92歲，其中>60歲896例(64.65%)。檢出率最高的為痰標(biāo)本，其次為鼻咽拭子、尿液。1 386株酵母在各標(biāo)本中的分布見(jiàn)表2。

2.2 真菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

1 386株酵母中，白假絲酵母、熱帶假絲酵母、光滑假絲酵母和克柔假絲酵母4種常見(jiàn)真菌對(duì)氟康唑的敏感率分別82.99%、79.19%、68.57%和28.95%；白假絲酵母對(duì)7種抗真菌藥物的敏感率依次為5-氟胞嘧啶(93.76%)、兩性霉素B(93.15%)、制霉菌素(84.58%)、伏立康唑(84.09%)、氟康唑(82.99%)、伊曲康唑(80.05%)和克霉唑 (78.09%)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表11386株酵母的分類

Tab.1Speciesdistributionof1386strainsofyeast

StrainnPercentage (%)Candida albicans81758.95Candida tropicalis22115.95Candida glabrata21015.15Candida kruse382.74Candida parapsilosis352.53Candida lusitaniae221.59Candida guilliermondii50.36Candida famata40.29Candida dubliniensis20.14Saccharomyces cerevisiae20.14Cryptococcus neoformans20.14Trichosporon asahii20.14Others261.88Total1386100

表21386株酵母在不同標(biāo)本中的檢出率及構(gòu)成比

Tab.2Isolationrateandconstituentratioof1386strainsofyeast

SpecimennPositiveIsolation rate (%)Constituent ratio (%)Sputum138074453.9153.68Urine99221121.2715.22Blood7267810.745.63Swab48613728.199.88Secretion5289517.996.86Others73312116.518.73Total4 845138628.61100

表31386株酵母對(duì)7種抗真菌藥物的敏感率(%)

Tab.3Sensitiveratesof1386strainsofyeasttosevenantifungaldrugs(%)

StrainnFluconazoleItraconazoleVoriconazoleAmphotericin B5- FlucytosineNystatinClotrimazoleCandida albicans81782.9980.0584.0993.1593.7684.5878.09Candida tropicalis22179.1981.9082.8190.0590.9580.5475.11Candida glabrata21068.5771.4373.8189.0572.3874.7671.43Candida kruse3828.9584.2144.7484.2126.3218.4218.42Candida parapsilosis3594.2997.1497.14100.00100.0094.2994.29Candida lusitaniae2295.4595.45100.00100.00100.0090.9190.91Candida guilliermondii580.00100.00100.00100.00100.00100.0080.00Candida famata450.0075.0075.00100.00100.00100.0075.00Candida dubliniensis2100.00100.00100.00100.00100.0050.0050.00Saccharomyces cerevisiae2100.00100.00100.00100.00100.0050.0050.00Cryptococcus neoformans2100.00100.00100.00100.00100.0050.0050.00Trichosporon asahii2100.00100.00100.00100.00100.0050.0050.00Others2665.3880.7784.62100.00100.0065.3861.54

3 討論

近年來(lái)，真菌感染已成為醫(yī)院感染的重要部分，尤其是由假絲酵母(白假絲酵母、熱帶假絲酵母、光滑假絲酵母)引起的侵襲性真菌感染呈上升趨勢(shì)。假絲酵母已是醫(yī)院感染的主要病原菌，成為僅次于大腸埃希菌、銅綠假單胞菌，居醫(yī)院感染第3位的病原菌。本研究顯示，在分離的1 386株酵母中仍以白假絲酵母比例最高，其次是熱帶假絲酵母和光滑假絲酵母，與國(guó)內(nèi)、外的監(jiān)測(cè)基本一致[4,5]。本研究結(jié)果還顯示，除常見(jiàn)的白假絲酵母和熱帶假絲酵母外，還檢測(cè)出阿薩希毛孢子菌、釀酒酵母、葡萄牙假絲酵母等過(guò)去少見(jiàn)的酵母。菌種分布呈多元化，這可能是由于近年來(lái)酵母分離、培養(yǎng)、鑒定的方法有所改進(jìn)，檢驗(yàn)人員對(duì)菌種鑒定給予足夠的重視；也可能是由于近年來(lái)抗真菌藥物的廣泛使用，使菌群分布發(fā)生了改變。因此，重點(diǎn)監(jiān)測(cè)以白假絲酵母為代表的假絲酵母屬感染是臨床預(yù)防和治療真菌感染的關(guān)鍵。此外，對(duì)臨床上其他酵母所致感染也要引起足夠重視。

1 386株酵母主要來(lái)源于痰標(biāo)本(53.91%)，與國(guó)內(nèi)報(bào)道相似[6]；其次是尿液。值得重視的是血液中假絲酵母的檢出率達(dá)10.74%，構(gòu)成比為5.63%。這可能與近年來(lái)器官移植、介入診治方法的廣泛開(kāi)展，以及化療、廣譜抗菌藥物的應(yīng)用有關(guān)。

1 386株酵母對(duì)7種抗真菌藥物的體外敏感試驗(yàn)結(jié)果表明，目前臨床常用的抗真菌藥物對(duì)常見(jiàn)的酵母均有較強(qiáng)的活性。使用兩性霉素B產(chǎn)生的不良反應(yīng)大，臨床用量較少。而氟康唑不良反應(yīng)小，較安全，能廣泛滲透至體液、組織和器官，對(duì)白假絲酵母、隱球菌感染療效較好，目前臨床廣泛使用；但由于其大量使用，部分酵母已出現(xiàn)耐藥。部分酵母同時(shí)對(duì)數(shù)種咪唑類藥物耐藥，提示咪唑類藥物之間存在交叉耐藥現(xiàn)象。當(dāng)前臨床經(jīng)驗(yàn)性抗真菌藥物治療常首選氟康唑，4種常見(jiàn)假絲酵母中白假絲酵母對(duì)氟康唑最敏感，這可能使非白假絲酵母逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌群。因此，有必要?jiǎng)討B(tài)監(jiān)測(cè)真菌菌群的構(gòu)成變化。臨床微生物實(shí)驗(yàn)室要加強(qiáng)真菌分離、培養(yǎng)和鑒定，建立抗真菌藥敏試驗(yàn)方法，加強(qiáng)對(duì)酵母樣真菌耐藥性的監(jiān)測(cè)，為臨床抗真菌感染治療提供有效的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

[1] 楊繼勇，趙慧，張軍民. 酵母菌引起深部感染的病原學(xué)特征 [J]. 中國(guó)醫(yī)院感染學(xué)雜志，2003，26(9)：579-580.

[2] 陳端，單斌，駢淮燕，杜艷，郭翀. 醫(yī)院真菌感染1 225例分析 [J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，28(4)：387-388.

[3] Denning DW, Muoz P. Advances in invasive fungal infection and antifungal therapy: introduction [J]. Clin Microbiol Infect, 2001, 7(Suppl 2). doi:10.1111/j.1469-0691.2001.tb00003.x.

[4] 黎永新，莫建坤，溫炬，張智，張珍. 480株念珠菌分型及體外藥敏試驗(yàn)分析 [J]. 中華醫(yī)藥雜志，2004，4(1)：8-10.

[5] Pfaller MA, Diekema DJ, Rinaldi MG, Barnes R, Hu B, Veselov AV, Tiraboschi N, Nagy E, Gibbs DL. Results from the Artemis Disk Global Antifungal Surveillance Study: a 6.5-year analysis of susceptibilities of Candida and other yeast species to fluconazole and voriconazole by standardized disk diffusion testing [J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(12): 5848-5859.

[6] 趙心懋，徐英春，段瓊，楊啟文，王澎，謝秀麗，陳民鈞. 氟康唑體外抗菌活性及五種體外敏感試驗(yàn)方法的比較 [J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，29(2)：128-132.