結核分枝桿菌熱休克蛋白GroEL1的研究進展

何磊，張鷺，彭超，王洪海

復旦大學生命科學學院遺傳學研究所遺傳工程國家重點實驗室，上海 200433

各種生物有機體，從低等的大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)、酵母(Saccharomycescerevisiae)、果蠅(Drosophilamelanogaster)到高等的植物、哺乳動物，在受周圍環境不利因素影響下，會通過快速、短暫的細胞代謝調節產生一系列適應性改變，在此期間細胞內一些正常基因的表達受抑制，某些特殊基因被激活，表現為暫時性下調或選擇性上調表達一組蛋白，這一現象稱為熱休克反應。該反應本質上是細胞對外界作出的一種自身保護性反應，所產生的蛋白就是熱休克蛋白(heat shock protein， HSP)。HSP是一種高度保守且廣泛表達的蛋白，最早在高溫培養果蠅時發現。正常情況下，HSP作為新生蛋白、非正常折疊蛋白和突變蛋白的分子伴侶，阻止蛋白質變性和聚集，協助蛋白質折疊、伸展、組裝和轉運，抑制錯誤折疊的蛋白質分泌，并參與細胞內對應激刺激的自我保護[1]。

HSP按相對分子質量大小可分為不同家族，主要劃分為泛素 ( ubiqutin )、HSP20、HSP60、HSP70、HSP90及大分子HSP家族。其中HSP60 和 HSP70 作為HSP的2個重要家族，具有高度的物種保守性，但不同家族的HSP無明顯序列同源性。HSP70已被深入研究，而 HSP60 的研究相對較少。HSP60在核酸序列及蛋白質組成上具有高度的保守性。不同生物間HSP60具有50%～90%同源性。原核生物中 HSP60 類似物是大腸埃希菌的伴侶蛋白 GroEL。GroEL伴侶分子在生物體內幫助折疊10%～15%細胞內蛋白[2,3]。雖然在大部分細菌中只有1組GroEL基因，但結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)基因組攜帶2組groEL基因，即groEL1和groEL2，分別編碼GroEL1(Hsp60、Cpn60.1)和 GroEL2 (Hsp65、Cpn60.2)蛋白。結核分枝桿菌GroEL1和GroEL2具有61%同源性，與大腸埃希菌分別有53%和59%同源性，與人Hsp60也有47%同源性[4]。

結核分枝桿菌中GroEL2具有20多個 T細胞抗原決定簇，其中1個是結核分枝桿菌和牛型結核分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)特異性的，具有很好的免疫保護與免疫治療作用[5]，是機體對抗結核分枝桿菌入侵的重要免疫保護性抗原之一，為細胞生存所必需的。研究發現，結核分枝桿菌感染的小鼠化學治療后接種groEL2 DNA，能清除殘余細菌，提示GroEL2不僅可作為預防性疫苗的候選組分，也可作為治療性疫苗的候選組分[6,7]。

GroEL1蛋白不是細胞生存所必需的，而是一種高度保守的細胞內抗原。機體感染結核分枝桿菌后會產生針對GroEL1的交叉免疫反應，可引起實驗動物自身免疫性疾病。有研究顯示，GroEL1比GroEL2具有更強誘導細胞因子產生的能力，使人外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)產生促炎癥反應細胞因子，如白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF α)、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)，但不能刺激產生保護性細胞因子γ干擾素(interferon γ，IFN γ)和 IL-4[8]。這種分子伴侶和免疫優勢抗原的雙重功能，以及在自身免疫性疾病中的作用，使得GroEL1越來越受到廣泛關注。

1 結核分枝桿菌GroEL1的發現

GroEL也稱HSP60，是典型的分子伴侶。人們對分子伴侶及其在蛋白折疊中功能的了解來自于對這種蛋白及其共伴侶分子HSP10(在原核生物中為GroES)的研究。GroES稱為輔分子伴侶(co-chaperonin)，因為GroEL在指導折疊過程中起重要作用，而GroES 輔助其活性功能。

在大腸埃希菌中，由于GroEL/GroES伴侶系統對至少13種重要蛋白的折疊是必需的，所以這些寡聚體蛋白對生長極其重要(GroEL是四聚體，GroES是七聚體)[9]。大部分細菌在單個操縱子中只有1份groES和groEL基因拷貝[10]。然而，基因組序列分析發現，大約15%的細菌擁有不止1份groEL基因，這些細菌主要是放線菌，結核分枝桿菌也屬此類。GroEL2在很久前就因其強免疫原性而被關注，被稱之為普遍抗原[11]。1993年，Kong等發現一個同源基因，命名為groEL1[12]。結核分枝桿菌中groEL1基因位于groES基因下游，表明它編碼這種生物主要的60kD蛋白(圖1)。

groES, codes for the Cpn10 antigen (HSP10);groEL1, codes for the Cpn60.1 antigen (HSP60);groEL2, codes for the Cpn60.2 antigen (HSP65).

圖1groES-groEL1順式操縱子和groEL2基因在基因組上的結構[13]

Fig.1GenomicorganizationofthegroES-groEL1operonandthegroEL2gene

2 結核分枝桿菌 GroEL1獨特的結構特點

通過對結核分枝桿菌GroEL結構的測定，研究者發現GroEL以二聚體形式存在[14]。每個亞單位由頂部(apical domain)、赤道部(equatorial domain)和中間部(intermediate domain)3個區域組成。GroEL A鏈由447個氨基酸殘基組成，B鏈由445個殘基組成，擁有與大腸埃希菌相似的折疊。在GroEL表面存在疏水區。GroEL1的面積比GroEL2大，赤道部出現一個疏水區與N端殘基電子密度有關。巧妙的構象變化影響不對稱單位中所有分子N端殘基螺旋的方向，可保護赤道區的疏水殘基[14]。

結核分枝桿菌GroEL的2個蛋白具有如下特點：低序列性的寡聚體形式而非四聚體，非常弱的ATP酶活性，在底物折疊方面非常弱的活性[15]。因此，人們開始懷疑GroEL的2個蛋白是否具有助折疊功能，質疑被感染宿主中結核分枝桿菌GroEL蛋白生物功能的本質[16]。

3 結核分枝桿菌GroEL1的功能

3.1 分子伴侶功能

許多分子伴侶是HSP家族的成員。分子伴侶通過結合和釋放的方式來識別非天然狀態的蛋白，幫助變性、不可溶的凝聚蛋白正確折疊，重新恢復天然構象, 從而提高細胞的應急耐受能力[17]。groEL1和groES編碼基因共同排列于groESL操縱子上，而groEL2單獨排列于染色體上。所有分枝桿菌的GroEL在熱休克、氧化應激反應、巨噬細胞感染時大量表達，比平時增加1%～10%[18-20]。

一般的細菌如大腸埃希菌在行使分子伴侶功能時均需要結合其輔助蛋白GroES和水解ATP供能。分枝桿菌卻不需要輔助蛋白和ATP的協助即能完成蛋白質重新折疊、組裝及轉運，通過赤道部疏水區結合未折疊的蛋白，防止錯誤折疊和聚集。輔助蛋白折疊需要耗能而使細菌新陳代謝緩慢，結核分枝桿菌改變了以往蛋白質折疊需要耗能的途徑，將ATP提供給更需要的環節。在檸檬酸合成酶體外折疊的實驗中證實，GroEL具有促進其重新折疊的能力，且這種能力不受輔助蛋白和ATP的影響[21]。

3.2 抗原

對致死率很高的結核病而言，GroEL1可作為一種接種抗原使用，并有望成為治療結核病的一種特效藥。GroEL1作為一種免疫刺激物，能刺激機體產生一定效價的抗體。通過雙向電泳和質譜鑒定所得蛋白質組分分析結果表明，在分別被牛型結核分枝桿菌和結核分枝桿菌感染后，眾多HSP(包括GroEL1)在宿主巨噬細胞中表達量增加。已確認HSP有細胞間信號轉導活性[22,23]，可能促成這種免疫原性在感染宿主中高表達，不同種類HSP高度的序列同源性也導致它們之間存在交叉反應的抗原表位，會產生較強的交叉反應。免疫系統一旦接觸特殊病原體的HSP，便可引起免疫記憶，誘導與其他生物體包括宿主HSP的交叉反應，當免疫系統再次感染時可啟動快速應答。在人和小鼠模型中，GroEL1是體液和T細胞應答的靶點[24]。在結核病、麻風病患者和感染結核的小鼠體內可檢測到GroEL1特異性抗體[25,26]。大約20%分枝桿菌反應性CD4+αβT細胞能識別結核分枝桿菌GroEL1[27]。

3.3 在抗原呈遞中的作用

除直接的抗原作用，HSP對免疫系統還有間接作用。體內病原體的傳染過程會經過一次熱休克反應，引起HSP含量增加，這些HSP被加工和作為外源因子可結合大量細胞內蛋白降解產生的肽。GroEL 作為HSP的一員，也會與這些肽段結合，從而形成GroEL-肽復合物。這些復合物被抗原呈遞細胞加工處理之后，肽段被傳遞到主要組織相容性復合物 (major histocompatibility complex，MHC)編碼的Ⅰ類或Ⅱ類分子，隨后這些MHC 多肽復合物被 T細胞識別。CD4(輔助性T細胞)和CD8(殺傷性T 細胞)等多種不同類型的 T 細胞識別HSP決定簇，有利于病原體清除[28]。

新近研究顯示，用結核分枝桿菌GroEL1轉染腫瘤小鼠，可減少致腫瘤性細胞。GroEL1有呈遞腫瘤免疫顯性抗原到細胞表面的作用[29]，顯示HSP有呈遞和攜帶抗原的能力。

4 新功能的發現及研究進展

4.1 蛋白伴侶分子

結核分枝桿菌中GroEL2是細胞生存所必需的，但無論是在肉湯培養基還是巨噬細胞中，groEL1突變體與野生型菌株都沒有區別，表明GroEL1對細胞生存是非必需的。但鼠感染研究表明，無論是在小鼠還是豚鼠中，groEL1突變體都不能產生肉芽腫炎癥，這與groEL1突變引起細胞因子表達減少有關[30]。因此，GroEL1可能是結核分枝桿菌感染中控制細胞因子依賴性肉芽腫產生的關鍵因子。也就是說，GroEL1激活原發性感染的細胞因子產物，維持感染的疾病狀態。然而，這種免疫調控功能是否代表分枝桿菌屬中GroEL1的主要作用仍懸而未決，因為這種蛋白也存在于非典型性分枝桿菌如恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)或非致病性物種中。

在條件致病性物種如恥垢分枝桿菌中，groEL1包含了整合噬菌體Bxb1的attB位點[31]，而且對于正常的浮游生長不可或缺。也有研究指出，GroEL1在恥垢分枝桿菌生物膜形成方面的作用：通過整合噬菌體Bxb1，恥垢分枝桿菌的groEL1基因失活，細菌呈現正常的浮游生長，但不形成成熟的生物膜。研究表明，GroEL1在KasA蛋白(一種參與分枝菌酸合成的Ⅱ型脂肪酸合成酶的關鍵成分)的幫助下，特別是在生物膜形成過程中，調控分枝菌酸-分枝桿菌細胞壁長鏈脂肪酸成分的合成[16]。雖然結核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌的GroEL1直系同源物，顯示高度的保守序列，但功能卻不相似。很可能分枝桿菌GroEL蛋白序列或者結構上的細微變化對其生物學活性產生了深遠影響，或者蛋白可能經歷了不同的翻譯后修飾。

最近研究表明，GroEL1保守蛋白的磷酸化是物種特異性的。在結核分枝桿菌中，GroEL1是一種Ser/Thr 蛋白激酶的底物，可以在Thr25和Thr54位點磷酸化，其中Thr25是關鍵的磷酸化接受位點。環境信號可引發GroEL1磷酸化，并可能影響其生物活性。Thr25磷酸化也許是導致病原體和非病原體物種GroEL1功能不同的原因。要證實Thr25磷酸化與誘導感染動物炎癥反應的聯系，需擁有GroEL1(T25A)等位基因的結核分枝桿菌同源菌株[32]。

相反，恥垢分枝桿菌中GroEL1不是Ser/Thr蛋白激酶F(serine/threonine protein kinase F, PknF)的底物。GroEL1通過物理性結合KasA和SMEG4308，完成主要的翻譯后修飾[16]。恥垢分枝桿菌中GroEL1(T25A)不同的磷酸化模式是否與KasA相互作用，繼而影響成熟生物膜形成，有待證實[32]。

GroEL1蛋白的不同表現表明這些分子并不是統一的，不同來源的GroEL1蛋白可以表達不同的生物活性。

4.2 DNA伴侶分子

研究表明，結核分枝桿菌GroEL1蛋白在進化過程中，獲得一種新功能，即以低特異性、高DNA親和力來結合DNA的能力，從而成為核酸相關蛋白(nucleoid-associated protein，NAP)的一員。GroEL1可有效保護DNA免受DNase Ⅰ和氫氧自由基的損害。原子粒顯微鏡研究表明，GroEL1可將一條大的DNA濃縮為一個緊密的結構。體內實驗證明，通過DNA雜交和免疫熒光圖像發現純核酸中存在GroEL1時兩者會發生相互作用，說明自然環境中GroEL1和DNA可相互作用[33]。

產生這一功能的原因可能在于GroEL1底物識別頂端區域的改變導致底物特異性從多肽轉變為多核苷酸。根據其二聚體而非四聚體的結構，推測這種蛋白寡聚狀態的改變可能來自于細微突變，具體原因未知[34]。

5 結語

分枝桿菌GroEL1作為基因復制的產物，不僅具有原始的助蛋白折疊功能，還可作為一種重要抗原被免疫系統所識別，在結核病的防治中具有重要的應用價值，而且在不同分枝桿菌中呈現出多種不同的生物學功能。結核分枝桿菌的GroEL1作為蛋白分子伴侶，幫助控制細胞因子依賴性肉芽腫的形成[35]；在恥垢分枝桿菌中，GroEL1作為蛋白分子伴侶，與分枝菌酸的生物合成有關。這對結核分枝桿菌在體內尤其在巨噬細胞內的生存有重要意義，基因敲除實驗結果進一步證實了這一點。GroEL1包含了整合噬菌體Bxb1的attB位點，對于恥垢分枝桿菌正常的浮游生長是不可或缺的，且其C端富含組氨酸殘基，對生物膜形成很重要。研究還發現它具有 DNA 分子伴侶功能，可保護DNA免受自由基侵害。GroEL蛋白序列或者結構上的細微變化對其功能可能產生深遠的影響，致使不同來源的GroEL1蛋白表達不同的生物活性[33]。

未來的研究將對致病菌和條件致病菌GroEL蛋白的不同功能進行分析，找出產生這些差異的具體原因，從而有助于找到合適的藥物靶點和(或)疫苗，為人類結核病的發生及進化機制的研究提供堅實的基礎和廣闊的視角。另外，致病菌GroEL1蛋白在進化過程中產生了新的功能，這種功能變化的具體原因也有待繼續研究。

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