結核分枝桿菌與巨噬細胞相互作用的研究進展

王靜嫻，楊春

重慶醫科大學病原生物學教研室/神經科學研究中心，重慶400016

結核病(tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)所致的以呼吸系統感染為主的慢性傳染病。近年來，結核病疫情嚴重，位居單一病原引起患者死亡的嚴重傳染病之首。目前全球結核感染者約占總人口的1/3，每年有930多萬人發展為活動性結核病，并有180多萬人死于該病[1]。大多數情況下，只有少數結核分枝桿菌感染者發展為活動性肺結核病；絕大多數感染者屬無癥狀和無傳染性的，即潛伏性結核感染。巨噬細胞是機體防御系統的第1道屏障，一方面發揮著抵抗結核分枝桿菌的作用，另一方面又是結核分枝桿菌體內滯留、造成潛伏感染的主要場所。巨噬細胞與結核分枝桿菌的相互作用對結核病的發生、發展、預后起著非常重要的作用，因此探討兩者的相互作用機制對結核病的防治尤為重要。本文就近年來該領域的研究進展作一綜述。

1 結核分枝桿菌對巨噬細胞的免疫逃逸機制

感染結核分枝桿菌后，只有少數感染者發展為活動性肺結核病，大多數為潛伏性結核感染。結核分枝桿菌通過多種機制逃避和對抗巨噬細胞的抗菌作用。

1.1 通過調節細胞信號傳遞以及改變攝取方式和代謝途徑逃避殺傷

結核分枝桿菌激活磷酸酪氨酸磷脂酶，表達主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類的抗原呈遞分子下調，使細胞信號傳遞受阻，呈遞巨噬細胞抗原的能力下降。結核分枝桿菌通過甘露糖受體(mannose receptor，MR)途徑被巨噬細胞攝取，阻斷補體受體介導的Ca2+信號通路，使之不能觸發巨噬細胞的殺菌效應，反而促進結核分枝桿菌在吞噬溶酶體內的存活[2]。當結核分枝桿菌被巨噬細胞吞噬后，其乙醛酸代謝途徑關鍵酶——異檸檬酸裂合酶(isocitrate lyase，ICL)表達水平明顯上升。結核分枝桿菌可能通過乙醛酸循環支路途徑的代謝逃避巨噬細胞的殺傷[3]。

此外，結核分枝桿菌胞壁上有一種貫穿胞質膜到細菌表面的不均一的高分子脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)成分，其末端帶有甘露糖殘基，作為MR介導結核分枝桿菌內吞。LAM被轉送至巨噬細胞膜，插入糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)豐富區，改變巨噬細胞的多種功能，有利于細菌的存活。LAM及結核分枝桿菌分泌的一些糖脂具有高效氧自由基清除作用，可抑制巨噬細胞呼吸爆發對結核分枝桿菌的殺傷[4]。

1.2 阻止吞噬溶酶體的融合

吞噬體吞入異物后，與內質體發生一系列融合和分離，這是一個膜表面蛋白與內質體的質膜循環進程[5]。一系列因子如載體、鐵清除分子、脂質合成分子涉及該過程，這些因子改變吞噬體融合和轉運可能是干擾結核分枝桿菌生存的主要策略之一[6-10]。研究顯示，結核分枝桿菌的某些菌體蛋白如早期分泌型抗原靶6/培養濾液蛋白10(early secretory antigenic target 6/culture filtrate protein 10，ESAT 6/CFP10/MTSA 10)和分泌型ATP1/2(secretion ATPase 1/2，SecA1/2)蛋白能阻斷液泡ATP酶和GTP酶積累，降低pH值，干擾吞噬體的成熟和功能[7,8]。結核分枝桿菌吞噬體含MHCⅡ類分子、轉鐵蛋白受體等大量早期內體分子標記，而溶酶體膜糖蛋白、CD63、cAMP-1、溶酶體相關膜蛋白2(lysosomal-associated membrane protein 2，LAMP 2)及Rab7(rabex-7，屬Rab蛋白家族)等晚期內體和溶酶體分子標記卻相當少，說明巨噬細胞中的結核分枝桿菌吞噬體可與早期內質體融合，而與晚期內質體的融合受抑制，吞噬體的成熟受阻[9]。改變吞噬體的酸化對結核分枝桿菌的胞內存活也有一定作用，而結核分枝桿菌能在巨噬細胞中存活、增殖說明含有結核分枝桿菌的吞噬體酸化發生異常。早期研究發現，結核分枝桿菌可選擇性外排質子-ATP酶，阻止吞噬體酸化，抑制Rab7產生，進而阻止吞噬溶酶體形成。結核分枝桿菌菌體富含脂質，如海藻糖霉菌酸酯可干擾細胞膜轉運、MHC分子表面呈遞，一定程度上反應性氮中間產物(reactive nitrogen intermediate，RNI)也被阻斷，所以活化的巨噬細胞對結核分枝桿菌介導的抑制效應不敏感[10-14]。

吞噬體中的結核分枝桿菌可分泌Ser/Thr蛋白激酶G(serine/threonine protein kinase G，PknG)，其存在也阻礙吞噬體與溶酶體的融合[7]。它有3個區即N端(Trx)、激酶和C端四聯重復肽重復區( tetratricopeptide repeat region，TPR)。Trx區缺失嚴重影響PknG活性，Thr63是活體內PknG磷酸化的唯一場所。宿主內PknG介導的結核分枝桿菌存活中，Trx基序和Thr 63殘基具有各自的重要性[15]。另外，巨噬細胞內結核分枝桿菌可借助空泡出芽而離開吞噬溶酶體，使液泡不能成熟，阻斷吞噬小體膜上液泡ATP依賴性質子泵的功能而逃避殺傷作用。近來研究表明，從結核分枝桿菌中分離的脂阿拉伯甘露聚糖衍生物——甘露糖化的脂阿拉伯甘露聚糖(mannosylated lipoarabinomannan，ManLAM)與MR相互作用而延遲吞噬溶酶體的融合消化。研究發現糖肽脂(glycopeptidolipid，GPL)與ManLAM一樣，通過MR調節吞噬溶酶體融合。GPL延遲吞噬溶酶體融合的能力依賴于巨噬細胞MR的表達[16]。

1.3 抵抗巨噬細胞氧依賴性殺菌系統的殺傷

氧依賴性殺菌系統包括反應性氧中間物(reactive oxygen intermediate, ROI)和RNI作用系統，它們是病原微生物入侵巨噬細胞的重要介質之一，感染后巨噬細胞內ROI和RNI水平均顯著上升。結核分枝桿菌雖可避免溶酶體的殺傷，但活化的巨噬細胞可發生呼吸爆發，產生大量代謝性自由基，通過強氧化作用和細胞毒作用殺傷病原微生物。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶及組氨酸等氧自由基清除劑并不能改變巨噬細胞內結核分枝桿菌生長的受抑現象，說明結核分枝桿菌對巨噬細胞產生的ROI具有高度耐受性。RNI系統中產生的胍氨酸和一氧化氮(nitric oxide, NO)，對入侵的結核分枝桿菌有殺傷和細胞毒作用。隨后的研究發現，在Mn2+存在時結核分枝桿菌產生的過氧化氫酶-過氧化物酶因具有過氧化物酶活性、細胞色素P450樣的加氧酶活性及過氧亞硝酸酶活性，可有效抵抗ROI及RNI對結核分枝桿菌的殺傷作用[17]。

1.4 減少巨噬細胞的凋亡

誘導自身凋亡是巨噬細胞殺滅病原微生物、限制其在體內播散的重要機制之一，但結核分枝桿菌毒力株能通過某些機制抑制巨噬細胞凋亡，從而維持其在巨噬細胞內的存活。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF α)是介導結核分枝桿菌感染后巨噬細胞凋亡的關鍵分子之一。結核分枝桿菌毒力株誘導產生的可溶性TNF受體2(soluble TNF receptor type 2，sTNF R2)參與對巨噬細胞凋亡的抑制，主要通過誘導sTNF R2釋放，降低Fas表達，阻斷誘導凋亡的通路，從而限制感染的巨噬細胞凋亡。此外，結核分枝桿菌還可刺激多種免疫細胞釋放白細胞介素10(interleukin 10，IL-10)，使sTNF R2釋放增加，從而阻斷TNF α的激活作用[14]。跨膜蛋白Bc1-2被認為是細胞凋亡調控的最后通路之一，通過控制細胞核內、外物質運輸，抑制Ca2+釋放或阻斷細胞內過氧化物堆積而發揮抗凋亡作用。結核分枝桿菌可能通過上調凋亡抑制因子Mcl-1(屬Bcl-2家族)的表達抑制巨噬細胞的凋亡。

1.5 降低巨噬細胞對刺激應答的敏感性

結核分枝桿菌感染早期誘導產生的大量γ干擾素(interferon γ，IFN γ)具有重要的抗結核及調節機體抗結核免疫反應的作用，能激活巨噬細胞吞噬和殺傷能力，增強抗原呈遞功能。研究發現，細胞因子信號轉導抑制因子降低巨噬細胞對IFN γ刺激的敏感性，導致巨噬細胞不能被充分活化[18]。LAM對巨噬細胞的凋亡產生影響，不僅改變IFN γ受體結構，使巨噬細胞對IFN γ的應答降低，還改變巨噬細胞表面標記，抑制巨噬細胞向CD4+T細胞呈遞抗原的能力，使巨噬細胞對IFN γ的敏感性降低。

結核分枝桿菌能被多個Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)識別。TLR是屬于IL-l受體家族的一種跨膜蛋白，其中TLR2更重要。結核分枝桿菌細胞壁上的19 kD脂蛋白能被TLR2識別，持續刺激巨噬細胞能降低IFN γ水平，減少抗原呈遞和MHCⅡ類分子的表達。ESAT 6可通過TLR2產生類似影響[19]。TLR2/4也曾被認為在結核分枝桿菌炎癥反應中起至關重要的作用[20]。但持續刺激TLR，機體會產生負調控，抑制過強的炎癥反應，如出現內毒素耐受等。結核分枝桿菌在機體內能長期存在可能就是通過這種負調控機制抑制IFN γ，降低適應性免疫應答而產生逃逸。TLR干擾IFN γ釋放似乎是一個潛在的致病機制[21]。MTSA 10是結核分枝桿菌RD-1區的一種特異性分泌蛋白(位于Rv3874開放讀碼框架區)，能調節巨噬細胞對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的應答并抑制巨噬細胞內LPS誘導的氧化劑產生。MTSA 10活化巨噬細胞的蛋白-酪氨酸磷酸酶(protein-tyrosine phosphatase，PTP)，活化的PTP能干擾晚期LPS信號，從而阻止巨噬細胞有效的免疫應答[22]。

2 巨噬細胞抗結核免疫機制

巨噬細胞是結核分枝桿菌寄生的場所，是機體獲得特異性抗結核免疫力的第1步。巨噬細胞的活化能限制結核分枝桿菌的生長，甚至殺滅結核分枝桿菌，在結核病防御中起著至關重要的作用，是宿主控制結核分枝桿菌感染播散的重要防御屏障。

2.1 吞噬體與溶酶體融合

溶酶體對吞噬的病原微生物進行殺傷是巨噬細胞發揮抗感染功能的重要機制之一。在一定條件下，巨噬細胞可將含結核分枝桿菌的吞噬體傳遞至溶酶體，借助溶酶體酶殺傷結核分枝桿菌。吞噬溶酶體成熟障礙和吞噬作用受抑制對結核分枝桿菌在體內長期存活很關鍵，巨噬細胞在吞噬過程中，神經鞘氨醇激酶(sphingesine kinase)發揮類似Ca2+信號驅動器作用，促進吞噬溶酶體成熟。結核分枝桿菌可通過抑制神經鞘氨醇激酶來抑制吞噬溶酶體成熟[23]。對于溶酶體內物質獲取吞噬泡而言，吞噬體表面的磷脂酰肌醇-3-磷酸鹽(phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P)是細胞膜上一種重要的調節運輸脂類，表達有PI3P的結核分枝桿菌吞噬體可很快與溶酶體發生融合，活的結核分枝桿菌可抑制晚期溶酶體對吞噬泡的溶解作用，并通過水解PI3P抑制吞噬溶酶體成熟[18]。

2.2 分泌多種細胞因子發揮免疫調節作用

在結核分枝桿菌和其他細胞因子的刺激下，活化的巨噬細胞可通過分泌多種細胞因子，如IFN γ、TNF α、IL-1、IL-6、IL-l2、IL-18及轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF β)等[19]，發揮免疫調節作用。IFN γ是激活巨噬細胞抵抗細胞內病原體的最主要因子，可增加巨噬細胞清除結核分枝桿菌的活性，誘導Th0細胞向Thl細胞分化，活化更多的效應細胞和細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)。TNF α可使很多免疫細胞游走并定位在結核分枝桿菌存在的部位，對包圍感染部位、防止病原體擴散起重要作用。IL-1、IL-6促進T細胞、B細胞增殖活化；IL-12能誘導IFN γ而抑制IL-4產生，激活自然殺傷(natural killer，NK)細胞和T細胞；IL-12及IL-18能促進T細胞、NK細胞增殖和分化，并產生IFN γ，增強機體細胞免疫功能；TGF β是阻止過度炎癥反應、減輕組織免疫病理損傷的細胞免疫抑制因子。

2.3 自由基對結核分枝桿菌的直接殺傷和誘導的細胞凋亡

研究發現，巨噬細胞吞噬結核分枝桿菌后可產生大量的ROI和RNI。對多種結核病患者的活組織檢查發現，結核性肉芽腫部位誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)濃度明顯增高[24]。研究表明，巨噬細胞感染結核分枝桿菌后，可通過誘導自身凋亡對其進行清除。其中，多種促凋亡因子參與結核分枝桿菌感染誘導的巨噬細胞凋亡過程，如TNF α、Fas-FasL系統、Bcl及Caspase家族[25]。

2.4 結核分枝桿菌抗原的呈遞

巨噬細胞是專職的抗原處理及呈遞細胞。巨噬細胞在吞噬結核分枝桿菌后，可將其蛋白降解為具有免疫原性的小分子肽段。這些短肽片段的不同抗原表位可分別與MHCⅡ/Ⅰ類分子結合后呈遞至巨噬細胞表面，分別激活CD8+和CD4+T細胞。T細胞通過表面TCR-CD3復合受體分子和CD4/CD8輔助受體分子與巨噬細胞表面相應抗原肽-MHCⅡ/Ⅰ類分子復合物結合后，可誘導T細胞產生活化的第一信號。在此基礎上，巨噬細胞通過表面B7和細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecular 1，ICAM 1)等黏附分子與T細胞表面CD28和淋巴細胞功能相關抗原1(lymphocyte functional antigen 1，LFA 1)等相應黏附分子結合，相互作用，產生T細胞活化的第二信號，隨之產生結核分枝桿菌抗原特異性T細胞，促進機體對結核分枝桿菌的特異性殺傷和清除。活化的T細胞同時可分泌IFN γ、IL-12、TNF α等細胞因子，以進一步增強巨噬細胞的功能。

3 結語

結核分枝桿菌感染是嚴重威脅人類健康的疾病之一。結核分枝桿菌存在于受感染宿主的巨噬細胞中，潛伏感染時機體免疫反應與其處于動態平衡，巨噬細胞在維持這種平衡中起著重要作用。結核分枝桿菌與巨噬細胞可通過一系列機制發生復雜的相互作用。雖然目前發現了兩者之間的一些關系，但由于存在非常復雜的作用機制，仍需進一步深入研究，以提高宿主巨噬細胞抗結核分枝桿菌的能力，這對結核病的防治有重要意義。

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