微生物富集方法及其應用的研究進展

張敬敬，劉曉穎，錢開誠

1. 華東師范大學、上海市血液中心研究生培養基地，上海 200051； 2. 上海市血液中心，上海 200051

微生物富集方法主要包括物理法和生物親和法2大類。常用物理方法包括過濾法(filtration method)、離心法(centrifugation method)等(表1)。生物親和法是根據微生物特性將其與固相載體結合以實現分離，它可分為特異性結合與非特異性結合2種，磁性分離法是生物親和分離法的一種。本文闡述過濾法、密度梯度離心法及磁性分離法3種富集微生物的方法及其應用，重點介紹磁性分離法及其在病原微生物富集及檢測方面的應用。

1 分離、富集細菌的物理方法及其應用

1.1 過濾法

過濾法富集微生物是將適當孔徑的濾膜放入濾器，過濾樣品。由于濾膜的作用而將微生物滯留在膜表面，使微生物與樣品溶液分開，達到微生物富集目的。臨床上常用富集微生物的濾膜孔徑為0.22 μm和0.45 μm，前者通常用于醫用注射液及化學溶液除菌，后者常用于富集體液如腦脊髓液[1]、痰液[2]中的微生物。Sankaran等[3]利用膜過濾法過濾分離人糞便中的志賀菌屬和大腸埃希菌，可有效去除后續細菌檢測的干擾因素。過濾法的優點在于成本低、速度相對較快且微生物濃縮效果明顯，適用于大體積樣本中微生物的富集。臨床上過濾法主要用于體液等樣品中的微生物富集，但較少用于有一定黏稠度的樣品，如全血或血小板等標本。原因在于一方面血液制品中含有與微生物大小相仿的其他細胞，無法完全將微生物與樣品完全分離；另一方面血液制品的黏稠度較大，易堵塞濾孔。

表1常用細菌富集方法的比較

Tab.1Comparisonofmethodsformicrobialenrichment

為進一步提高過濾法富集細菌的效率，Zierdt等[4]利用帶正電的濾膜通過靜電吸附作用使革蘭陽性菌從樣品中分離，原理在于革蘭陽性菌的細胞壁含有磷壁酸，帶有負電荷。細菌荷電性的大小與所在樣品的電解質、pH值、細菌種類及生長階段有關，通過對這些參數的優化可進一步提高細菌的分離、富集效率。另外，交錯流過濾技術為解決濾孔堵塞問題提供了幫助。原理如下：在泵的推動下樣品平行于膜面流動，與垂直過濾不同的是樣品流經膜面時產生的剪切力把膜面上滯留的顆粒帶走，從而減少濾膜堵塞。此外，還有濾器生產商為減少堵塞、加速過濾而采用緊貼于濾膜的“攪拌”裝置。

1.2 離心法

離心法是借助于離心力，對比重不同的物質進行分離的方法。在臨床基礎研究中，常用直接離心法和密度梯度離心法來分離樣品中的微生物。直接離心法是在不加入介質的條件下，直接對樣品中的細菌進行離心分離，使大部分細菌沉降于管底，達到將細菌分離、富集的目的。然而，直接離心的同時樣品中與靶細菌密度相近的其他成分也會隨之沉淀，影響分離后細菌的純度。

密度梯度離心法(density gradient centrifugation method)是用一定的介質在離心管內形成連續或不連續的密度梯度，將細菌混懸液置于介質的頂部(底部或混勻)，根據細菌在密度梯度液中的比重不同，通過離心力的作用使靶細菌分離。密度梯度離心法通常分為速率沉降和等密度沉降2種。速率沉降適用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器，等密度沉降適用于分離密度不等的顆粒。密度梯度離心常用的沉降介質有蔗糖、氯化銫、Ficoll液、Percoll液等，其中Ficoll液、Percoll液常用于細胞分離。Ficoll液為聚蔗糖，Ficoll-Paque PLUS(Ficoll-泛影酸鈉)是無菌、即用型的，有合適的密度、黏度和滲透壓，能夠簡單、快速地從人外周血、骨髓和臍帶血中分離淋巴細胞及單個核細胞。Percoll液是一種表面包被聚乙酰胺吡咯烷酮的硅膠顆粒，無毒、無刺激性，對細胞無吸附作用，產生的滲透壓很小，可在全部密度范圍保持等張。

Ficoll液、Percoll液也可用于微生物細胞的分離、富集。Zierdt等[4]將Ficoll密度梯度離心法與膜過濾法結合，用于人全血中的大腸埃希菌、肺炎克雷白菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、銅綠假單胞菌、唾液鏈球菌、肺炎鏈球菌等12種細菌的富集、分離。與傳統的血培養方法相比，密度梯度離心法的富集效率明顯提高。另有研究應用Ficoll等密度梯度離心法成功富集培養基中的枯草芽胞桿菌。Lindqvist等[5]利用Percoll密度梯度離心法富集食物勻漿中的大腸埃希菌O157∶H7，通過細菌的富集，減少后續聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測細菌時的干擾因子。Arakaki等[7]將該法用于宿主細胞中鮭魚立克次體的富集，在所選用的不同濃度Percoll液中，發現30%的Percoll液最適于立克次體的富集。此外，該法還可用于紅細胞內伯氏瘧原蟲的分離等。密度梯度離心法富集微生物的缺點在于成本昂貴，可處理的樣品種類、體積有限，且難以實現不同種類微生物的分離，因而造成大量微生物丟失。由于分離介質等干擾因素的存在，需對富集后的微生物進行洗滌處理，整個實驗過程較為繁瑣。

2 分離、富集細菌的生物親和方法及其應用

生物親和法是指利用2種物質的高親和性，如通過抗體和抗原特異識別或基團共價結合等，純化和分離靶物質。磁性分離技術是生物親和分離法的一種，分為非特異性與特異性(免疫)磁性分離(immunomagnetic separation, IMS)2類。

2.1 細菌的非特異性磁性分離

未經包被單克隆抗體的超順磁性Fe3O4粒子為裸磁珠。有研究表明[6]，裸磁珠可非特異性吸附細菌，對大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、副溶血性弧菌等常見病原菌的富集率高達98%。對裸磁珠非特異性吸附細菌的吸附率、實驗條件及參數進行優化(如磁珠規格、保存方法、用量、孵育時間及溫度等)，將為裸磁珠在細菌富集領域的應用奠定基礎。

除裸磁珠外，可用于細菌富集的材料還有生物納米磁珠(bacterial magnetic particle, BacMP)、蒙脫石(montmorillonite, MMT)等。生物納米磁珠是在磁性細菌(magnetic bacteria)菌體內形成，直徑50～100 nm。磁珠中心主要成分為超順磁性Fe3O4顆粒，外層包被約14 nm有機生物膜，與人工合成磁珠的包被層相比，其厚度均勻，與中心磁珠結合緊密，不易脫落，易于進行化學修飾及抗體包被，且在溶液中的分散度好，便于提取，成本低廉[7]。生物納米磁珠已被用于多種細菌的富集和檢測[8]及細菌DNA抽提[9]。蒙脫石是一種硅酸鹽礦物，含有2層硅氧四面體中間夾有鋁氧八面體的“車廂式”結構，各層間產生強弱不同的永久性負電荷，該“車廂式”結構能將細菌固定到“車廂”中。研究發現，納米蒙脫石顆粒對多種細菌如大腸埃希菌、霍亂弧菌、空腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌均有較好的吸附作用。但蒙脫石只吸附表面帶有粒編碼蛋白(CS31A)的病原菌，對表面不帶CS31A的正常菌群無吸附作用。蒙脫石一般用于治療腹瀉，對其在微生物富集和檢測方面的報道尚為少見[10]。

2.2 細菌的免疫磁性分離

免疫磁性分離技術是利用包被有單克隆抗體的納米磁珠，與含有相應抗原的靶物質結合，通過磁場作用將結合有靶物質的磁珠富集，從而達到純化、富集目的。免疫磁珠由超順磁性Fe3O4顆粒構成核心，其外包被氧化硅或多聚物如聚苯乙烯、聚氯乙烯等，外層也可連接各種基團。不同磁珠包被材料有不同用途，根據氧化硅可特異性吸附核酸的特性。通常將包被氧化硅的免疫磁珠用于核酸的富集和分離；而包被聚苯乙烯的免疫磁珠可結合羧基、氨基等，多用于蛋白的分離和純化；也可根據實驗需要將特異性單克隆抗體包被于裸磁珠上而發揮不同用途。此外，磁珠顆粒的直徑、表面基團等也對富集效率有影響。磁珠的直徑及其均勻度影響其在溶液中的分散度、磁響應度、聚集力等，各種直徑規格及用途的磁珠均在不斷研發中，典型的磁珠直徑有1.0 μm、2.8 μm、4.5 μm等。1.0 μm常用于體外診斷和高通量分析，2.8 μm磁珠多用于富集蛋白質、多肽、抗體、酶、激素、受體等，4.5 μm磁珠常用于富集細胞或細胞器等。磁珠的表面基團種類繁多(如羧基、氨基、甲苯磺酰基、環氧基、醛基、羥基、羰基等)，可與抗體、受體、寡核苷酸鏈等結合，形成磁性生物材料，用于靶向目標分子的富集。免疫磁性分離技術可用于分離核酸、蛋白質、病原體及各種細胞等，具有高特異性、高濃縮性、高分離率，且可從大量細胞中篩選出帶有特異性標記的極少量細胞而不影響細胞活性。免疫磁性分離技術因簡便、易行、分離純度高、能保留靶物質活性等優點而被廣泛應用于基礎及臨床研究中。磁性分離技術亦是近年來應用于細菌學診斷的有效方法之一，可將分散在樣品中的少量細菌富集，從而顯著提高細菌的檢測效率，且富集過程僅需10 min～1 h。但磁性分離技術應用于細菌的特異性分離受到包被抗體種類、抗體價格及分離細菌種類等方面的限制。

2.3 磁性分離技術在病原微生物檢測中的應用

目前常用的病原微生物檢測有應用顯微鏡等技術的物理、化學方法，以及針對病原微生物抗原或抗體的免疫學方法。這些檢測方法可處理的樣品體積有限，因此有效的病原微生物富集方法顯得尤為重要。隨著研究的日益深入，免疫磁性分離技術與酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、PCR、熒光定量PCR、流式細胞技術、免疫熒光顯微技術等相結合，已被廣泛用于臨床病原微生物的檢測[11]。

2.3.1富集后用于病原微生物的細胞檢測檢測病原微生物細胞主要根據微生物物理、化學特性或特異性蛋白直接采用流式細胞技術、免疫熒光技術等進行檢測。Hibi等[12]將磁性分離技術與流式細胞技術結合，用于水中黃桿菌冷菌(10～108CFU/ml)快速檢測與計數。以直徑1 μm的兔抗黃桿菌冷菌IgG抗體包被的羰原微生物核酸的分子生物學方法，基磁珠作為黃桿菌冷菌磁性富集的固相載體，在抗體上標記異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)對富集后的細菌用流式細胞儀進行檢測與計數，發現流式細胞計數與磁性分離技術結合后，可將黃桿菌冷菌檢測的靈敏度從106CFU/ml提高至10 CFU/ml，整個細菌檢測過程可在2 h內完成。還有學者將磁性分離技術與側向流動技術(lateral flow method)結合，用于檢測水中和奶制品中的炭疽桿菌芽胞[13]。此外，磁性分離技術還被廣泛用于各種免疫分析，如熒光免疫分析、酶化學發光免疫分析等[14]。磁珠結合一抗或二抗后，可用于微生物的分離與定量，可省去離心步驟，節約時間，簡化操作，且顯著提高檢測效率與準確性。有學者采用熒光免疫分析法，將FITC與抗大腸埃希菌單克隆抗體結合，并固定于生物納米磁珠上，用于檢測和去除大腸埃希菌。免疫磁性分離技術已被用于富集與檢測多種病原微生物，如人糞便中的幽門螺桿菌、尿液中血吸蟲循環抗原以及水體中的賈第蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊等[15]。

2.3.2富集后用于病原微生物的核酸檢測利用免疫磁性分離技術捕獲樣品中的靶病原菌，可顯著提高病原菌核酸檢測效率。有研究將免疫磁性分離與PCR結合，用于人血清和尿液中細螺旋體的檢測。他們用包被抗LipL32單克隆抗體的蛋白A磁珠，首先對人血清和尿液中細螺旋體進行富集，再用PCR檢測富集后的細螺旋體，檢測效率高達162 CFU/ml。

2.3.3富集后用于病原特異性蛋白的檢測有學者[16]將免疫磁性分離技術與激光解離質譜技術結合，檢測金黃色葡萄球菌腸毒素蛋白B。此外，有關病原菌磁性分離的試劑盒產品已有許多，如大腸埃希菌、沙門菌、李斯特菌、軍團菌磁性分離試劑盒。基本原理是通過磁珠表面的高親和力抗體與病原菌表面標記物結合來分離靶細菌，整個分離、富集過程僅需1 h，檢測效率及自動化程度均明顯提高。

3 微生物富集的其他方法

除以上常用微生物富集方法外，最近有學者[17]將微流體技術與熒光激活細胞分選技術用于人全血(紅細胞濃度約108/ml)中大腸埃希菌的富集，可將全血中的大腸埃希菌濃縮300倍。微流體技術是指在微觀尺寸下控制、操作和檢測復雜流體的技術，可將流體樣品的制備、生化反應、結果檢測等步驟集成到生物芯片上(如樣品DNA制備、PCR反應、電泳檢測)，使實驗所用流體的量從毫升、微升級降至納升或皮升級。此外，還有學者根據細菌的特性，采用凝膠吸附方法富集靶細菌。Kuyukina等[18]根據紅球菌具有與烷烴高親和的特性，應用多聚丙烯酰胺凍凝膠，在含多種細菌的培養基中特異性地吸附紅球菌，富集效率達72%。原理是細菌通過表面蛋白與凝膠中的配基發生特異性結合而被吸附到凝膠上，從而達到細菌的富集和分離。

4 結語

微生物富集作為提高微生物檢測效率的有效途徑，在生物醫學及臨床等領域一直備受關注。常用的微生物富集方法有過濾法、離心法、磁性分離法等。過濾法和離心法是根據微生物的物理特性，非特異性地富集微生物，適用的菌種較廣泛，但在實際應用方面存在一定不足。如過濾法容易出現堵塞濾孔，無法用于黏稠樣品中的微生物富集及特異性分離靶微生物等。密度梯度離心存在成本高、操作繁瑣、靈敏度低等不足，仍需進一步改進，提高特異度及靈敏度，簡化操作。磁性分離技術已被廣泛應用于免疫學、分子生物學、生物動力學、基因工程等各領域，包括高通量的核酸、蛋白質、細胞及細胞器、微生物的分離，免疫分析，病原體檢測，生物大分子之間相互作用的研究等。隨著激光質譜、微陣雜交[19]等高新檢測技術的不斷發展，磁性分離技術與之結合將有更大的應用空間。總之，因磁性分離技術具有快速、低成本、可自動化調節、高特異度等優點，故在分離技術的自動化與微型化方面有廣闊的應用前景。

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