上海部分地區兒童艱難梭菌相關性腹瀉的臨床分析

馮云,王傳清,金嘉琳,張文宏

1. 復旦大學附屬華山醫院感染科，上海 200040； 2. 復旦大學附屬兒科醫院細菌室，上海 201102

艱難梭菌相關性腹瀉(Clostridiumdifficile-associated diarrhea，CDAD)是指糞便艱難梭菌毒素檢測陽性、有腹瀉或血便等臨床癥狀的疾病[1]。20世紀末，艱難梭菌感染率在美國仍然保持平穩狀態(每10萬人中30～40例)；但21世紀初以來，感染率迅速上升(至2005年每10萬人中84例)，尤其是嚴重感染者急劇增加。加拿大2003年艱難梭菌感染率較以前增長了3倍多，且病死率高達6.9%[2]。美國得克薩斯州2005年CDAD死亡例數是1999年的6倍，醫院內CDAD相關死亡例數增加了4.5倍，護理院則增加了7倍[3]。而美國2001～2006年對住院兒童CDAD監測顯示其發病率也顯著升高[4]。艱難梭菌可造成一系列疾病，從自限性腹瀉到危及生命的敗血癥、結腸穿孔、中毒性巨結腸等[5]，嚴重感染者的結局可能是腸道切除，甚至死亡[2]。但我國對CDAD的研究較少，近年來無明確的感染率數據[6]。復旦大學附屬華山醫院曾在腹瀉患者中進行了1年的CDAD監測，但未發現高毒力艱難梭菌菌株的存在[7]。發生CDAD的危險人群主要是長期應用抗生素者，尤其是年老、體弱的住院患者，兒童并不是艱難梭菌感染的危險人群。但最近數據顯示，兒童及無抗生素應用史者中CDAD病例數開始增多[8,9]。為了解我國腹瀉患兒中艱難梭菌的感染情況，本文對復旦大學附屬兒科醫院2007年2～9月腹瀉患兒的糞便標本進行了艱難梭菌腸道感染的監測，并對數據進行了分析。

1 材料和方法

1.1 材料

納入標準：有腹瀉或血便癥狀、留取標本前30 d內有抗生素使用史、年齡<14歲患兒的糞便樣本。排除標準：確診其他病原體引起的腹瀉。根據以上標準，共入選111例。

1.2 方法

1.2.1送檢標本的糞常規鏡檢用基于酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)的VIDAS CDA2試劑盒(bioMerieux S.A.，法國)檢測糞便艱難梭菌毒素A，并做艱難梭菌糞便厭氧培養。所有患兒基本情況見表1。

表1病例基本情況

Tab.1Basicinformationoftherecruitedcases

Basic informationMedian (range)Age9 months (2 d-14 years old)Diarrhea duration6 d (1 d-2 years old)Gender (female/male)45/66

1.2.2分組將入院前2 d內發生腹瀉的患兒分入院外腹瀉組，將入院2 d后發生腹瀉的患兒分入院內腹瀉組；將腹瀉病程2周以內定義為急性腹瀉，2周～2個月定義為遷延性腹瀉，2個月以上定義為慢性腹瀉。比較院外腹瀉組與院內腹瀉組的急性、遷延性、慢性腹瀉患兒中CDAD所占比例。

1.2.3同源性分析對糞便培養出的艱難梭菌，用多位點可變數目串聯重復序列分析(multiple-locus variable-number tandem repeat analysis，MLVA)技術進行同源性分析。該法為用7對引物分別對7個重復片段區域(表2)進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增。擴增條件為95 ℃ 5 min； 然后95 ℃ 1 min，48 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 30 s，共35個循環；最后72 ℃ 5 min[10]。PCR產物送Invitrogen公司進行測序，對測序結果進行重復片段計數。并用SPSS15.0軟件中hierarchical cluster法對結果分析，與參考文獻[10]中的菌株共同做成樹狀圖，顯示同源性關系。

2 結果

2.1 糞便艱難梭菌毒素A檢測及培養結果

111名病例中未發現艱難梭菌毒素A檢測及艱難梭菌培養均為陽性者，艱難梭菌毒素A檢測陽性而艱難梭菌培養陰性者16例(即CDAD 16例)，艱難梭菌毒素A檢測陰性而艱難梭菌培養陽性者4例，艱難梭菌毒素A檢測和艱難梭菌培養均為陰性者91例(表3)。

2.2 病例臨床分析

16例CDAD患者(CDAD組)腹瀉病程中位數為6.5 d，最短1 d，最長3個月；糞常規檢查中，白細胞數超過5個/高倍鏡視野者3例；糞便主要以黃稀便為主，另有1例為黏液膿血便，1例為柏油樣黑便及黃稀便，1例為綠色稀便伴黏液膿血。在這些患者中，低出生體重早產兒3例，伴中樞神經系統感染者5例，伴呼吸系統感染者3例，伴尿路感染者2例，伴皮膚感染者2例，單純以腹瀉入院最終診斷為假膜性腸炎者1例。

表2MLVA目的VNTR片段及引物[10]

Tab.2ThetargetVNTRsequenceandprimersusedforPCR

VNTR nameRepeated motifPrimers used for PCRCD4TTGCTCCDR4F (5′-ATTAATCATATCCTACAGAACACGA-3′)CDR4R (5′-TAAAACAAATGATATAAACTGAAAAG-3′)CD5TATATTG/AGCDR5F (5′-AATTTTAAGTTAACGTTTTTCTACAT-3′)CDR5R (5′-AGCCATTTTTATCAATCCTTTCTAT-3′)CD9TAAAAGAGCDR9F (5′-TCTGGGATGTAACTAGCGACTTGT-3′)CDR9R (5′-TCTTAGGGAATTTATTGGAGGAA-3′)CD48ATAGATTCDR48F (5′-AGGAGCTTTATATGGACATTCAGGTAG-3′)CDR48R (5′-AATCTCTTTCAAACTCTTCAATCTCAAT-3′)CD49AT/AC/TTTCTCDR49F (5′-AACATATTTAGGCATTTTAGTC-3′)CDR49R (5′-GAGTATTATTTATCATTTGTGGGTATTA-3′)CD59TAAG/ATATA/GGAT/CCDR59F (5′-GTAGAAGGGGCAAATAATGAG-3′)CDR59R (5′-CCTTCTGGCTTCCTTGTAATA-3′)CD60G/ATAAA/GTAGGATG/ATAAAACDR60F (5′-GGTGCACATGCTGGTCCTG-3′)CDR60R (5′-AACGCATTAAATTTCAC-TCCTCATAC-3′)

表4院內、外CDAD發生率的比較

Tab.4ComparisonofincidenceofCDADinchildrenwithhospital-acquiredandcommunity-acquireddiarrhea

TotalHospital-acquired diarrheaCommunity-acquired diarrheaAcute diarrhea13.58%(11/81)23.08%(6/26)9.09%(5/55)Persistent diarrhea18.18%(4/22)20.00%(1/5)17.65%(3/17)Chronic diarrhea12.50%(1/8)0.00%(0/0)12.50%(1/8)Total14.41%(16/111)22.58%(7/31)11.25%(9/80)

表3糞便艱難梭菌毒素A檢測及艱難梭菌培養結果

Tab.3DetectionofClostridiumdifficiletoxinAandcultureofClostridiumdifficile

Number of casesC. difficile culture (+)C. difficileculture (-)C. difficile toxin A (+)016C. difficile toxin A (-)491

The cut-off value forC.difficiletoxin A is 0.40.

比較院內、外組3種不同病程腹瀉患兒中CDAD的發生率，均無顯著差異(表4)。

4例糞便艱難梭菌培養陽性而艱難梭菌毒素A檢測陰性的患者(非CDAD組)均為院外出現腹瀉，其中3例為黃稀便，1例為黃稀便帶黏液血絲。腹瀉病程1～8 d。2例糞便白細胞數超過10個/高倍鏡視野，另2例糞便未發現白細胞，但伴有呼吸系統感染。

91例艱難梭菌培養和艱難梭菌毒素A檢測均陰性的病例無艱難梭菌感染相關證據，糞便主要以黃稀便為主，腹瀉病程1 d～2年；糞常規檢查中白細胞數超過5個/高倍鏡視野者25例，伴其他部位感染者35例，新生兒5例(其中低出生體重早產兒2例)。

比較CDAD組與非CDAD組患兒腹瀉病程、糞便白細胞計數，均無顯著差異(結果未列出)。

2.3 臨床治療

16例CDAD患者中，2例加用甲硝唑治療后腹瀉好轉，2例加用去甲萬古霉素治療后腹瀉好轉，1例低出生體重早產兒因合并新生兒壞死性腸炎而行造瘺手術治療。其他所有患者，均用第3代頭孢菌素抗感染和(或)十六角蒙脫石(思密達)、培菲康對癥治療后腹瀉好轉。

2.4 同源性分析

從入選患者的糞便標本中培養出4株艱難梭菌，分別為EK17、EK18、EK23和EK35，用MLVA對其同源性進行分析 (圖1，圖中其他菌株來自參考文獻[4]中的數據)，發現EK17與EK23的親緣關系較近，與EK35略遠，EK18與其余菌株的同源性最遠。

圖14株培養陽性艱難梭菌同源性關系樹狀圖

Fig.1Dendrogramforthe4isolatedC.difficilestrains

3 討論

本研究從糞便培養出4株艱難梭菌，艱難梭菌毒素A檢測均為陰性。但是由于有少量毒素A陰性而毒素B陽性的艱難梭菌毒株存在，故對僅有毒素A檢測陰性者雖考慮CDAD的可能性較低但尚不能完全排除。該4例培養陽性病例均為社區散發病例，急性起病，入院前2周內無住院史。腹瀉治療用藥均為普通抗生素，如第3代頭孢類抗生素，或用十六角蒙脫石等對癥治療，平均腹瀉病程3.25 d。故結合臨床，考慮該4例患兒均為不產毒艱難梭菌感染的可能性較大。對該4株艱難梭菌進行MLVA鑒定，結果發現EK17、EK23、EK35間存在一定同源性，而EK18與前3者相差甚遠。目前鑒定艱難梭菌同源性的方法有很多，包括MLVA、擴增片段長度多樣性分析(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、表面蛋白A基因序列分型(surface layer protein A gene sequence typing，slpAST)、核糖分型(PCR-ribotyping)、脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)分型、限制性內切酶分析(restriction endonuclease analysis，REA)等。國外文獻報道，這些方法均能檢測出CDAD暴發菌株，但只有MLVA和REA能區別不同的CDAD暴發菌株。根據對各方法鑒定效果的評分結果，MLVA得分最高[11]，其結果比較可信。根據病史及鑒定結果，可推測上海部分地區腹瀉患兒發生的艱難梭菌感染是散發的，但彼此之間存在一定同源性。

在111名腹瀉患兒中，14.41%(16/111)為CDAD。國外報道，用組織培養細胞毒性試驗檢測糞便艱難梭菌毒素，在有抗生素使用史的患者中，陽性率為9%～23%[12]。雖然兩者檢測手段不同，但陽性率并沒有很大差異，而本研究檢測艱難梭菌毒素A所用的ELISA比組織培養細胞毒性試驗更簡便。以前國外研究認為，CDAD主要散發或者暴發于醫院、護理院和慢性病診療中心，而社區發生率要低很多。在醫院或護理院等地，艱難梭菌的傳播主要是糞-口途徑，通過醫療相關工作者的接觸而進行傳播。患者在大量使用廣譜抗生素后對CDAD易感，CDAD發生率較高[5,13]。但近年來，該認識與許多社區獲得性CDAD病例的發生明顯不符，且在社區進行抗生素治療的患者中CDAD發生率亦不低[14]。本研究比較院內、外CDAD的發生率，顯示急性、遷延性、慢性腹瀉之間無顯著差異；分別比較急性、遷延性、慢性腹瀉患者中院內與院外CDAD發生率的高低，也未發現統計學差異。說明在本研究入組的患兒中，CDAD的發生與腹瀉病程、院內或院外等因素無明顯相關性，與以往認為CDAD病程長、好發于院內的觀點有所不同。這可能與本研究病例數不夠多有關，也可能與本研究病例主要為有抗生素應用史患兒有關，還可能與我國的醫院管理模式不同于國外的護理院模式有關。國外研究認為，嬰兒的腸道黏膜尚未成熟，艱難梭菌毒素難以與其結合，從而產生一定的保護作用[5,15]。本研究中早產兒占CDAD病例總數的18.75%(3/16)，這可能也是CDAD病程沒有想象中長的原因之一。

本文為回顧性研究，存在一定的局限性，包括未對糞便進行艱難梭菌毒素B檢測，病史收集可能存在一定偏差，但結果可為進一步深入前瞻性研究提供一些依據。另外，本研究對培養出的艱難梭菌進行MLVA可成為今后鑒定CDAD暴發的較好手段。糞便艱難梭菌毒素A檢測目前在臨床應用尚不普遍，本研究中檢出的陽性率較高(16/111)，是診斷CDAD的重要標準之一，但未觀察到該毒素的陽性結果與臨床嚴重程度的相關性。

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