丙型肝炎病毒核心基因置換對病毒復制和感染影響的初步研究

黎剛，曹明媚，王文博，任浩，戚中田

第二軍醫大學微生物學教研室，上海市醫學生物防護重點實驗室，上海200433

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是導致輸血后肝炎的主要病原體之一，與肝硬化和肝細胞癌高度相關[1]。HCV核心(core)蛋白是HCV的重要結構蛋白，是一個具有膜蛋白特征的二聚化α螺旋蛋白[2]，由191個氨基酸組成，序列十分保守，各分離株的同源性超過95%。核心蛋白是從基因水平治療HCV感染和進行疫苗研究的重要區域，它在病毒增殖、慢性致病、肝細胞癌變、免疫功能障礙中起重要作用[3]，也是病毒衣殼包裝和產生感染性病毒顆粒的必要因素之一[4,5]。

核心蛋白在體外可非特異性結合核酸[6,7]。Duvignaud等[8]認為，核心蛋白可能通過N端區域包裝基因組RNA。N端82個氨基酸缺乏二級結構，在體外和酵母中能有效誘導并形成核衣殼樣顆粒(nucleocapsid-like particle，NLP)，而Majeau等[9]發現，僅需N端79個氨基酸就足夠在體外形成核衣殼蛋白。核心蛋白能與包膜糖蛋白E1和E2作用，與包膜區蛋白共同形成HCV的核衣殼[10,11]。

目前，核心蛋白在HCV復制中的作用還不明確。Goh等[12]用酵母雙雜交系統研究發現，核心蛋白能與NS5A的N端部分共沉淀，兩者相互作用所需的NS5A最小序列包括干擾素敏感決定區(interferon sensitivity-determining region，ISDR)、蛋白激酶R(protein kinase R，PKR)結合區和富含Pro的區域。核心蛋白和NS5A通過與其他蛋白共同作用形成一個復合體結構，但對病毒復制和感染性病毒顆粒組裝的具體作用還不清楚。Fan等[13]發現，核心蛋白可特異性結合HCV基因組的5′非編碼區，抑制病毒的翻譯過程。核心蛋白是與病毒RNA結合的核衣殼蛋白，而NS5A在HCV的復制中起重要作用，可以推測核心蛋白通過與其他蛋白直接或間接作用參與病毒的復制和組裝。

為探討HCV型間差異對病毒復制和感染的影響，本研究采用我國高流行性的HCV1b型HC-J4的核心區平行置換2a型FL-J6JFH1的相應基因，構建FL-J6JFH/J4 core復制子，轉染Huh7.5.1，分析核心基因置換后在病毒復制、蛋白翻譯和感染性病毒顆粒產生能力方面的變化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1質粒、菌株、細胞株和培養基含有HCV2a J6JFH1株全長基因組的質粒pFL-J6JFH1由美國洛克菲勒大學HCV研究中心Charles M. Rice教授惠贈。含有HCV1b型J4全長cDNA的質粒pGEM-J4和大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)DH5α由本實驗室保存。Huh7.5.1細胞由中國科學研究院巴斯德研究所鐘勁研究員提供。

1.1.2試劑QuikChange?LightningSite-Directed Mutagenesis Kit為Stratagene公司(美國)產品。異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，X-gal)、NZ胺(酪蛋白的酶促水解物)、酵母提取物等購自北京鼎國生物技術有限責任公司。14 ml BD Falcon聚丙烯管購自上海雅怡科學實驗設備有限公司。異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記的羊抗人IgG購自Jackson免疫研究所(美國)。M-MLV反轉錄酶及T7體外轉錄試劑盒(RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7)購自Promega公司(美國)。LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司(美國)。RNA抽提試劑購自上海華舜生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1HCVJ4核心區的聚合酶鏈反應采用重 疊延伸聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)的方法，以pGEM-J4為模板，擴增出J4 核心基因片段(該片段兩端含有J6核心基因兩端配對序列)，所用上游引物為J4-C-F： 5′-AAGCTTATGCATCACCATCACCATCACAGC-ACGAATCCTAAACC -3′，下游引物為J4-C-R：5′-GGATCCGAAGCGGAAGCTGGGATGGTC-3′(下劃線：引入的互補配對序列)。

1.2.2HCVJ4核心置換的pFL-J6JFH/J4core復制子的構建回收J4核心片段后作為大引物(megaprimer)，以pFL-J6JFH為模板進行熱循環反應，擴增出pFL-J6JFH/J4 core質粒，DpnⅠ消化原始的pFL-J6JFH模板后，轉化、鑒定，得到pFL-J6JFH/J4 core復制子，具體方法參照Stratagene公司的QuikChange?Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit操作說明。

1.2.3HCVRNA轉錄體的制備和Huh7.5.1細胞轉染將FL-J6JFH1、FL-J6JFH/J4 core經XbaⅠ線性化后，用T7體外轉錄試劑盒制備RNA體外轉錄體，RNase-free DNaseⅠ處理完全去除DNA模板后，用Tris飽和的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提RNA，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和純度。體外轉錄成RNA后用脂質體轉染Huh7.5.1細胞，轉染方法和步驟參照Invitrogen公司的LipofectamineTM2000試劑盒要求。

1.2.4轉染細胞內HCVRNA水平檢測設計HCV 5′非編碼區的特異性引物(上游引物為F-HCVN：5′-GCGTTAGTATGAGTGTCGTG-3′；下游引物為R-HCVN：5′-TCGCAAGCACCCTATCAG-3′)，預期產物213 bp。設計內參照人GAPDH擴增引物(上游引物：5′-TGGGCTACACTGAGCACCAG-3′；下游引物：5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT-3′，預期產物100 bp)。

轉染后第5天，抽提轉染細胞內RNA，轉錄成cDNA后以雙標準曲線法[14]進行定量。HCV檢測的標準品是含有全長HCV cDNA的質粒FL-J6JFH1 PCR后的純化產物(稀釋梯度為10-3～10-9)，GAPDH 的標準品是純化后的PCR產物(稀釋梯度為10-1～10-6)。將兩者梯度稀釋，分別繪制標準曲線。各實驗組樣品的Ct值與標準曲線對比，計算檢測樣品的濃度。經內參基因GAPDH均一化后，即可算出轉染細胞內HCV RNA的水平。

1.2.5轉染細胞內HCV蛋白表達細胞的檢測RNA轉染后第8天，以丙型肝炎患者血清(預實驗結果表明，以HCV單克隆抗體檢測的熒光結果弱于患者血清，故本文選取患者血清作為一抗進行免疫熒光檢測)為一抗，羊抗人-FITC為二抗，免疫熒光法(immunofluorescence assay, IFA)檢測轉染細胞中HCV蛋白的表達。Olympus倒置顯微鏡(CK40)觀察并拍照記錄。

1.2.6轉染細胞上清液HCV感染性檢測收集轉染后第8天的細胞上清液，1 467g離心10 min，去除可能存在的細胞碎片，分裝后保存在-80 ℃。na?ve Huh-7.5.1 按每孔3×104個細胞接種到96孔細胞培養板，置含5% CO2的37 ℃培養箱孵育至40%～50%融合。加入收集的細胞上清液，繼續培養72 h。以丙型肝炎患者血清為一抗，IFA檢測轉染細胞中HCV蛋白陽性細胞。Olympus倒置顯微鏡(CK40)觀察并拍照記錄。

2 結果

2.1 HCV J4核心置換的pFL-J6JFH/J4 core復制子的構建與體外轉錄

PCR擴增出HC-J4的核心基因片段(圖1)，克隆到pMD18-T載體上后進行測序驗證，用基因置換方法構建了pFL-J6JFH/J4 core復制子，經測序驗證，J6核心基因被J4核心基因成功置換。將FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4 core經XbaⅠ線性化體外轉錄成RNA，2%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，大小為6 000～10 000 bp(圖2)。

M, DNA marker 2000; 1, J4 core fragment.

圖1HCVJ4核心的PCR擴增結果

Fig.1AmplificationofJ4corebyPCR

1, FL-J6JFH1; 2, FL-J6JFH/J4 core; M, RNA marker 10000.

圖2FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4core轉錄體電泳

Fig.2GelelectrophoresisofsyntheticRNAtranscriptsofFL-J6JFH1andFL-J6JFH/J4core

2.2 轉染細胞內HCV RNA水平的變化

將FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4 core RNA轉錄體用脂質體介導轉染Huh7.5.1細胞。轉染細胞傳代培養，第5天用熒光定量反轉錄-聚合酶鏈反應(fluorescent quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，FQ-RT-PCR)檢測轉染細胞內HCV RNA水平。FL-J6JFH/J4 core的RNA水平約為5.6×105GE/μg RNA，與野生型相當，無顯著性差異(n=4，P>0.05)。結果如圖3所示。

mean±SD.n=4,P>0.05.

圖3轉染第5天細胞內HCVRNA水平

Fig.3IntracellularHCVRNAlevelsatday5post-transfection

2.3 轉染細胞內HCV蛋白陽性表達細胞的檢測

FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4 core RNA轉染細胞后第8天，以丙型肝炎患者血清為一抗，羊抗人-FITC為二抗，IFA檢測轉染細胞中HCV蛋白陽性細胞。Olympus倒置顯微鏡(CK40)觀察并拍照。為更直觀比較陽性細胞數目的差異，選擇放大倍數為×100。結果表明，野生型FL-J6JFH1的陽性細胞數占細胞總數的50%，而FL-J6JFH/J4 core陽性細胞約占30%，低于核心置換前的野生型FL-J6JFH1株的水平(圖4A)。

2.4 轉染細胞上清液HCV感染性檢測

FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4 core RNA轉染細胞后第8天，收集細胞上清液，孵育 na?ve Huh-7.5.1細胞，培養72 h后用IFA檢測HCV的表達。觀察同上。與對照FL-J6JFH1相比，FL-J6JFH/J4 core的陽性細胞數減少(圖4B)。

圖4轉染第8天和用收集的第8天上清液孵育na?veHuh7.5.1細胞后的HCV陽性細胞的免疫熒光檢測

Fig.4ImmunofluorescenceassayofHCVproteinsinHuh7.5.1cellstransfectedwithRNA(A)orinfectedwithsupernatantsfromtransfectedcells(B)atday8

3 討論

本研究用基因置換法構建了HCV FL-J6JFH/J4 core嵌合復制子，體外轉錄成RNA后轉染Huh7.5.1肝癌細胞。Wakita等曾做過RNA 印跡(Northern blot)實驗，結果在轉染后12 h檢測到降解的RNA轉錄體，24 h即可檢測到新產生的HCV RNA[15]。本研究檢測到轉染后第5天FL-J6JFH/J4 core細胞內RNA水平與野生型FL-J6JFH1相當，這意味著在復制起始或延伸過程中，HCV J6核心和J4核心與其他復制相關蛋白結合的活力可能相當，高度保守的核心區在HCV各株間自由置換對HCV的復制能力不起或起較小作用。

HCV FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4 core RNA轉染細胞后第8天，IFA檢測轉染細胞中HCV的表達。結果顯示，FL-J6JFH/J4 core陽性細胞數占細胞總數的比例與野生型相比明顯下降，提示J4核心基因替換后引起HCV蛋白翻譯能力減弱，原因可能是在HCV結構或非結構蛋白翻譯過程中，J4核心蛋白與翻譯相關蛋白作用的活性弱于J6核心蛋白。說明核心蛋白可能對HCV蛋白的翻譯有較大作用，各株之間相互置換，雖然氨基酸序列變化不大，但在一定程度上改變了HCV的蛋白翻譯能力。

收集HCV FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4 core RNA轉染細胞后第8天的細胞上清液，孵育na?ve Huh7.5.1細胞。IFA檢測發現，與對照FL-J6JFH1相比，FL-J6JFH/J4 core的陽性細胞數大幅減少。表明在HCV感染性病毒顆粒的包裝或釋放過程中，J4核心基因置換后會降低與其他相關蛋白的作用，使整體感染力降低。在IFA檢測實驗中，我們嘗試使用NS3或NS5A的單克隆抗體，但效果不如用丙型肝炎患者血清敏感。Kato等[16]研究發現，HCV的開放閱讀框架(open reading frame，ORF)編碼的多聚蛋白前體，在宿主細胞信號肽酶和病毒蛋白酶作用下，裂解產生核心蛋白前體(p23)，再經膜內蛋白酶SPP(信號肽酶)作用，形成成熟的p21[17,18]。成熟的p21有明顯的二級結構，并能自折疊形成大至24個單體的多聚體，其中C端的125～179位氨基酸起重要作用。核心蛋白多聚體的具體功能還不清楚。Kunkel等[6]認為，核心蛋白11S可能是HCV病毒顆粒組裝的中間體形式，組裝時核心蛋白積聚，可加速病毒核衣殼的形成，降低形成感染性病毒顆粒所必需的核心蛋白與其他蛋白的相互作用。用J4核心區平行置換野生型FL-J6JFH的核心區后，有可能影響核心蛋白的加工、成熟、自組裝和功能性11S蛋白作用的發揮。

上述初步研究表明，HCV 核心蛋白很可能在HCV感染性病毒顆粒的釋放中起重要作用。目前，我們正在長時間觀察FL-J6JFH/J4 core RNA轉染細胞后RNA的消長，以及核心基因置換后對感染性病毒顆粒的影響，以進一步明確核心蛋白在HCV復制和感染性顆粒產生中的作用。

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