雙光子顯微鏡技術在腦功能研究中的應用：腦片、整體腦結構樣品和活體腦

張靜思,孫長凱,樸 花

(1.大連醫科大學 七年制臨床醫學系2005級，遼寧 大連116044；2.大連醫科大學 生理學教研室和腦疾病研究所，遼寧 大連 116044)

在熒光顯微鏡領域中，雙光子顯微鏡(two-photon laser scanning microscopy,TPLSM)在過去20年里是一種不可或缺的工具，TPLSM的優勢在神經科學的離體和活體組織研究中發揮著重要的作用。

TPLSM圖像具有鮮明的高對比度，結合其內在三維分辨率及對生物組織的優越穿透深度，使該技術的應用非常廣泛[1]。腦結構成像是神經科學領域重要的研究方法之一，它為腦組織的形態及功能研究提供重要依據。但腦組織的密度、復雜性及其對光線的散射作用，給高分辨率的光學成像和生物活性化合物(籠狀化合物)的活化過程造成了障礙，而雙光子顯微鏡的應用可有效減少這些障礙[2,3]。1990年，Denk等[4]最先使用飛秒脈沖激光對TPLSM的作用進行了測試和應用：兩個光子的同時吸收使TPLSM具有內在的三維成像功能，熒光激發及光漂白的發生均被限制在聚焦平面處。此外，TPLSM在光化學尤其是光解釋放籠狀分子方面的優勢更為突出。TPLSM的上述優勢使其在對腦組織結構成像的過程中較單光子顯微鏡有了長足的進步。

1 雙光子顯微鏡的一般概況

Ania Majewska等研究并介紹了他們將共聚焦系統改造為雙光子顯微鏡的過程，這一系統包括激光器、光學平臺和顯微鏡。改裝過程相對簡單，可在短時間內完成。改裝所得的激光掃描顯微鏡很靈活，較商業雙光子裝置花費少。雙光子顯微鏡能將熒光基團的激發局限于一很小的聚焦平面內，該特性使雙光子顯微鏡較單光子共聚焦顯微鏡具有如下優點：(1)增加了激發光線的穿透深度。TPLSM聯合熒光鈣指示劑，使對活體大鼠的體內研究深度達到了500 μm處的錐體神經元；(2)因為聚焦平面外不會產生熒光，觀察過程中顯微鏡不需要針孔，所以熒光收集的效率得以提高；(3)雙光子激發顯著降低總體光漂白和光損傷效應，從而實現了長時間的成像。Squirrell 等人使用TPLSM研究倉鼠胚胎內的線粒體動態分布，頻繁成像時間可長達24 h，而單光子共聚焦成像8 h即會造成明顯的組織損傷；(4)局限化的激發可用來光解籠狀化合物。如可用來研究Ca2+相關的亞微米級研究領域對Ca2+的釋放作用，包括一些離子門控通道，Ca2+敏感的酶類及Ca2+依賴性細胞生理過程等；(5)通過對熒光光致漂白恢復過程的觀察，可對具有熒光基團的物質進行研究，如觀察大鼠海馬切片中樹突棘和樹突干之間的物質交換及神經營養因子的彌散率[5]。共聚焦顯微鏡和TPLSM的比較性研究顯示，目前一些共聚焦顯微鏡因其光線不夠充分，從而不能使后焦平面得到有效均勻的照明，這是影響共聚焦顯微鏡最終分辨率的一個限制因素。并且，擴大共聚焦顯微鏡的針孔不但不會帶來寬視野分辨率，反而會使分辨率較寬視野顯微鏡更低。相反的，在雙光子和二次諧波顯微鏡的實際應用中沒有針孔和理論上的限制因素的存在。對于TPLSM，照射后焦平面的光線是十分充足的，因而完全解決了上述影響最終分辨率的限制因素，在TPLSM的實際應用中將不會造成任何障礙?？傊?，“共聚焦”這一技術上提高的全部優點均能在非線性(雙光子和二次諧波)顯微鏡得到充分的體現[6]。

2 雙光子顯微鏡在神經組織切片和整體分離樣品中的應用

神經組織的切片研究盡管有其局限性，但目前仍在神經科學研究中占有重要的地位。在大鼠海馬結構急性切片研究中，TPLSM和全細胞膜片鉗的聯合應用證實基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)在棘突增大和突觸強化過程中起必不可少的作用。實驗中，結合雙光子長時間成像和全細胞膜片鉗記錄可同時監測CA1神經元的棘突大小及突觸反應(興奮性突觸后電位)。在長時程增強的過程中，MMP-9的作用是一種局部的、指導性的細胞外信號，此信號可以協調地鞏固突觸結構和功能性的修飾，確保這些對于學習和記憶有重要意義的修飾的持續性。這里描述的嗅球細胞可塑性機制有可能是MMP-9參與認知功能的有力的論證[7]。

應用雙光子激發顯微鏡對活體急性切片中的呼吸性神經元進行鈣成像。樣品中包含前包欽格復合體，前包欽格復合體中含有對呼吸節律的產生有重要意義的神經元。傳統熒光成像的時間分辨率是充分的，可達10 Hz，甚至更好，但因聚焦點外熒光的影響，傳統熒光顯微鏡的z軸分辨率受到了限制。雙光子激發顯微鏡可有效解決這一問題，因為它的激發過程局限在圍繞聚焦平面的很小的范圍內(盡管z軸的分辨率依舊低于x或y軸)。但是，針孔濾過技術的一個缺點就是時間分辨率較低。此實驗結合細胞類型特異性表達熒光蛋白的轉基因小鼠的活體急性切片樣品、雙光子激發顯微鏡及鈣指示劑染料，證實甘氨酸的抑制作用在功能上與前包欽格復合體驅動的網絡活動是一體性的，因而，局部甘氨酸抑制環路對于呼吸節律的產生和維持具有重要意義[8]。

在有關錐體細胞水通道的實驗中，有研究者應用TPLSM對錐體細胞的胞體、樹突及棘突進行了觀察，且對切片內深達60～150 μm的苔狀纖維進行了20 min的成像過程。該實驗表明神經元缺少功能性的水通道蛋白，從而使其在滲透壓急劇變化時仍能保持一定的體積。然而，在這一應用過程中，TPLSM表現出一些不足，如切片體積的變化會使聚焦平面上的神經結構移位(盡管這種移位本身也是膠質細胞體積變化的一種指示)。另外，缺氧缺糖情況下經常能觀測到熒光物質的褪色，這也會給成像造成一定的困難[9]。

人們推測嗅球的中間神經元可調節它的輸入和輸出，但尚不清楚中間神經元對嗅球功能所起的具體作用，且人們對新生中間神經元的功能了解得更少。有研究者在此展示了一種新方法，這種方法可用來研究小鼠嗅球內大量新生顆粒細胞的空間分布模式。應用雙光子顯微鏡在單細胞的分辨率水平上對嗅球冠狀切片(250 μm)進行半自動成像是該方法的基礎。這一方法可辨別出嗅球內數千個標記神經元的確切位置，因此可降低抽樣誤差。為了驗證概念，研究者對兩個嗅球中的新生顆粒細胞進行了成像和分析。結果證明這種大規模的三維分析可以揭示較薄組織切片不能提供的信息。在研究過程中，盡管雙光子成像經證實可以穿透厚組織深達500 μm以上，但對深部組織的成像，其質量也有一定的下降，尤其在嗅球中。當對嗅球切片175～200 μm以上深度進行成像時，圖像顯示的熒光較弱且綠色熒光標記蛋白較少。檢測到的細胞密度降低是由于釋放的光學信號減弱所造成的，只有最亮的細胞才可被檢測到。這一問題在不同的組織中是不同的，所以在不同的樣品中應進行不同的評估[10]。

盡管器官切片和培養等方法在神經科學研究中十分重要，但它們固有的一些不足也是不容忽視的。在器官切片培養的條件下，神經元及其網絡的很多特性都不能正常發育，如星形膠質細胞的成熟過程。另外，神經元形態的發生有賴于多種因素，而這些因素是很難在體外模擬的，諸如神經元的活動模式、神經營養因子及神經調節系統的存在。因此，對完整腦結構進行研究對神經科學的發展具有重要意義[11]，故目前在整體情況下進行的研究日益增多。將鼠斷頭取腦后，將腦置于用含氧和蔗糖的冷人工腦脊液浸泡過的濾紙上。然后將其置入盛有人工腦脊液的培養皿中，沿中線切開。將海馬和覆于其上的新皮層從腦干上分離。再用解剖刀將海馬及新皮層從剩余腦組織上分離下來。將一尼龍刷放進側腦室將海馬結構從覆蓋著的新皮質中卷出來然后在下托部位切斷。制備新皮質和海馬的整體結構樣品的目的在于創建一種既有腦片優點(如保持了神經元固有的特性)，又可避免心臟和呼吸運動影響的標本。另外，這些標本還有一些重要的新品質，如保存了局部所有的輸入和輸出途徑、避免了切片和三維組織結構保存時所造成的表面損傷。此外，也證實了這些整體樣品的長期(hours)活力。TPLSM成像技術可對整體樣品從表面至400 μm的深度進行觀察，見圖1[12]。這些樣品和雙光子顯微鏡技術的結合無疑會為神經科學的整體研究工作帶來新希望。

3 雙光子顯微鏡在活體動物的完整腦結構中的

應用

如今，雙光子顯微鏡已更多的用于觀測活體動物的完整腦結構，從而為研究提供進一步的便利。以膠質細胞的研究為例，為明確星形膠質細胞在信息處理中的作用，研究者面臨的主要挑戰正是從半完好的樣品研究轉向活的、整體動物，以使星形膠質細胞的活動處于與皮質網絡活動直接相連的條件下。因為星形膠質細胞不能像神經元一樣通過電生理學方法來研究，TPLSM成像技術成為一種重要的替代方法，它的激發光線可以輕易的透過皮層組織，深達約150 μm，且不會造成明顯的組織損傷[3]。又如，在小鼠局灶性缺血模型的相關研究中，TPLSM也起到了非常重要的作用。此模型的制備提供了TPLSM對體內腦組織進行成像的一種方法：將小鼠顱骨厚度減小至≈20 μm。此削薄技術不會造成神經結構的改變，同時TPLSM的成像深度自軟腦膜表面可深達約100～200 μm，最后，獲得的圖像可進行選擇性三維重建。該模型使研究者能同時監測栓塞物的發展和活體小鼠中樹突結構對缺血發生的反應及變化[13]。最近，對小鼠新皮質體驗-依賴性結構可塑性的研究中，研究者也利用了活鼠體內TPLSM成像技術[14]，以脊柱受損小鼠為模型，定量研究其血管和軸突網絡的動態變化。研究者發明了一種專門的非侵入性體內成像流程，它可檢測脊柱內受損軸突的變性和再生的動態過程，同時它也可對同一動物血管網的變化進行監測。以往研究中常難以區分存活軸突和新生軸突，重復成像過程提供了區分存活的軸突和新生軸突的一種獨特方式。實驗發現，再生的軸突在生長過程中傾向于與血管緊密接觸，因為血管在營養方面為軸突提供了獲得適宜環境的快速通道。這種親和性持續的時間超過了血管生成反應的高峰期，同時也涉及到非新生血管，如足背靜脈。這種神經血管間的相互作用增加了軸突萌芽的動力，也使軸突延長的速度達到了驚人的程度(高達80 μm/h)。這種體內延時實驗鮮明的突出了這一現象。而實驗過程中由于組織光學特性的限制，穿透深度僅達脊柱背索表面的200 μm，這些部位的血管形成在控制條件下是比較適宜的[15]。

圖1 雙光子顯微鏡對小鼠整個海馬結構中齒狀回的成像(A)完整海馬齒狀回的顆粒細胞層和分子層。顆粒細胞的樹突從胞體發出直達分子層并向外朝著表面。箭頭示從顆粒細胞胞體延伸出的軸突遠離表面；(B)齒狀回顆粒細胞在較高放大倍數時的成像。箭頭示離開胞體的軸突。樹突延伸自胞體的其它面并朝著海馬結構的表面行進Fig 1 Dentate gyrus of the mouse whole hippocampal formation (HF) imaged with 2PLSM(A) Granule cell layer and molecular layer of the dentate gyrus in the intact hippocampus.The dendrites of the granule cells extend from the cell body through the molecular layer and out towards the surface.The arrow indicates an axon extending from a granule cell body away from the surface；(B) A higher magnification image of granule cells in the dentate gyrus.The arrow indicates the axon exiting the cell body.The dendrites extend from the other side of the soma and travel toward the surface of the hippocampal formation

用雙光子激光切斷脊柱中綠色熒光蛋白標記的單根感覺神經元軸突，可造成較小的損傷，且周圍神經組織中形成的瘢痕也較小。在研究感覺神經元再生能力時，利用了雙光子損傷模型。研究表明，周圍損傷將導致中央損傷的感覺神經元中再生相關性基因上調。經外周軸突損傷處理過的背根神經節神經元，在中央損傷之前已表達了軸突生長所必須的分子。應用體內成像技術發現，經條件處理(外周軸突損傷)的軸突迅速開始生長，并在48 h內，組織瘢痕尚不明顯的情況下穿越損傷部位。研究數據證明，背根神經節神經元的慢性損傷可引發強大的再生潛力。然而，生長能力的實現會因損傷部位的創傷性改變而受阻。結果提示，誘導的條件效應，結合一定的干預來減少瘢痕抑制神經元生長的本性，這將為慢性脊柱損傷提供極具前景的治療方法[16]。

盡管人們已確信，神經元活動是動物行為最為主要的一個決定性因素，但星形膠質細胞的激活與動物行為間的關系仍不明了。小腦伯格曼膠質細胞是放射狀星形細胞，它們參與運動行為，且有鈣離子激發活性。然而，以往少有人探討動物行為中這些細胞中的鈣離子激發。通過雙光子顯微鏡，研究者發現在清醒活動中的小鼠，伯格曼膠質細胞表現出三種形式的鈣離子激發，其中兩種發生在小腦蚓部。當小鼠表現為運動時，至少有上百個伯格曼膠質細胞網絡中出現了協調性的鈣激發，這些細胞網絡的范圍可達幾百微米甚至更多。麻醉、阻斷神經活動或谷氨酸傳輸均可破壞鈣離子的協調性激發。由此可得出，伯格曼細胞的大網絡可被特定的動物活動所激活，并有可能通過足量振幅的激活來啟動腦組織動力學或血流的宏觀變化。研究者發明了一種雙光子成像方法，對清醒狀態下、頭部固定的小鼠小腦進行成像。在此過程中，小鼠可在健身球上移動，研究者就可以探討覺醒狀態和運動行為是如何影響正常情況下伯格曼膠質網絡中鈣離子的激發,見圖2[17]。

圖2 對行為小鼠小腦皮質的雙光子顯微鏡檢查

用雙光子顯微鏡檢查覺醒著的頭部受限且使用健身球的小鼠。小鼠的運動通過光編碼器示蹤，此編碼器對運動的開始/偏移、速度及方向提供敏感、定量、可重復的示值讀數。此外，通過錄像記錄小鼠的行為
Fig 2 Two-Photon Microscopy in Cerebellar Cortex of Behaving Mice

Two-photon microscopy in awake,head-restrained mouse using an exercise ball.Mouse locomotion is tracked by an optical encoder on the ball,which provides a sensitive,quantitative,and repeatable readout of running onset/offset,speed,and direction.In addition,mouse behavior is recorded by a video camera

在一定范圍內，正常組織生成局部信號的方式之一是多個伯格曼神經膠質細胞的突起部位同時產生自發性鈣波。利用TPLSM技術，研究者首次展示了在活體完整的腦組織內，嘌呤型機制可以激發細胞間的鈣波傳遞[18]。

4 雙光子顯微鏡技術的局限性和未來發展趨勢

盡管雙光子顯微鏡被廣泛應用于不同的研究體系中，但它仍受限于一個相當小的光譜窗口。目前，雙光子顯微鏡的光源依舊是Ti：Sa飛秒激光提供的大約在700～1000 nm之間的輸出。因此，雙光子的有效激發波長局限于350～500 nm之間。S.Quentmeier提出克服這些局限的方法之一就是將雙光子激發擴展為雙色雙光子激發。雙色雙光子激光掃描顯微鏡(two-color two-photon laser scanning microscopy,2c2pLSM)的試驗裝置中，使用的是Ti：

Sa 800 nm的基本輸出和400 nm的二次諧波。這些光柱在時間和空間上的重疊可以達到雙色雙光子的吸收和266 nm的有效激發波長。因此，使用2c2pLSM的顯微鏡其激發范圍可以達到紫外光，如230～330 nm。因為此范圍剛好適合于色氨酸的吸收光譜(色氨酸是一種與大多數固有的蛋白熒光相關的氨基酸，色氨酸相當于一種自然的內置監測器)。因此，2c2pLSM顯微鏡不僅可以檢測非標記的蛋白質，而且可以監測蛋白質的反應及構象變化。

使用280 nm光線單光子激發色氨酸是最顯著的方法，但在共聚焦或寬視野熒光顯微鏡中使用這一波長進行激發會引起很多問題，包括紫外線的光毒性、短波長光線的散射問題，以及所需的特殊光纖、具有理想孔徑的物鏡的限制。相比之下，2c2pLSM較小的激發面積和較長的波長可以解決這些問題。研究者展示了MIN 6(Pancreatic β cell line,MIN6)細胞的第一張2c2pLSM熒光圖像，從而證實了該方法在活細胞內紫外熒光基團成像過程中的實用性。另外，有研究者使用時間門控相機結合檢流計-光學光束掃描(galvo-optic beam scanning)證實了2c2pLSM可監測生物素與親和素的結合過程[1]。

相信在未來的發展過程中，雙光子顯微鏡在神經科學及諸多其他科學領域中的應用前景將會更加寬廣。

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