創傷弧菌FJ03-X2株培養條件的優化研究＊

許斌福,陳秀錦,劉曉東,林能鋒,劉新華,劉景瑜,林天龍

創傷弧菌FJ03-X2株培養條件的優化研究＊

許斌福1,陳秀錦2,劉曉東1,林能鋒1,劉新華1,劉景瑜1,林天龍1

目的 探討創傷弧菌毒株FJ03-X2的優化培養。方法以創傷弧菌毒株FJ03-X2進行實驗,研究搖瓶培養溫度、接種量、培養基、初始p H值、溶解氧等因素對菌株生長的影響,確定最適培養條件為:TSB培養基初始p H值為7.0,適宜接種量10%,培養溫度28℃,裝液量25mL/250mL,轉速180r/min。培養菌數可達8×109cfu/mL,生物量為25mg/m L。以 TSB為基礎培養基,采用單因子和正交實驗相結合的方法,確定最佳培養基主要成份為:葡萄糖0.2%、胰蛋白胨1.8%、大豆胨0.4%和玉米漿0.4%。以最佳培養基配方給菌體提供營養,在最適培養條件下培養,可以使培養液中的細菌生物量高達50mg/mL以上。結果得出創傷弧菌FJ03-X2的優化培養條件和培養基配方。結論國內首次優化鰻源創傷弧菌培養條件,并給出相關依據。

創傷弧菌;培養;優化

創傷弧菌(V ibrio vulnif icus)是一種低度嗜鹽性弧菌,屬于人魚共患病病原,能導致人與鰻鱺產生敗血癥和嚴重傷口感染〔1〕。上個世紀70-80年代,曾讓日本和歐美等國的鰻鱺產業遭受巨大的經濟損失〔2〕;近五年來,我國沿海地區養殖的鰻鱺因創傷弧菌而引起發病也十分嚴重,臨床上呈現急性和遷延性兩種過程,養殖鰻鱺的創傷弧菌病可反復發作,造成嚴重經濟損失。許斌福等〔3〕制備創傷弧菌ISCOM疫苗免疫鰻鱺預防創傷弧菌病,但疫苗的大規模研制必須面對高效培養的瓶頸問題,因此進行創傷弧菌發酵培養優化研究具有重大意義。

目前,國內外的創傷弧菌研究主要側重于流行病學和致病機理〔4〕等方面,比較少關注疫苗的研制與開發,尤其是培養優化方面。而細菌培養工藝研究主要集中在大腸桿菌等工業微生物〔5〕,弧菌培養工藝至今少見報道。因此,本研究選用了毒力較強、免疫原性好〔6〕的鰻源創傷弧菌 FJ03-X2,以 TSB為基礎培養基進行培養條件和培養基優化的研究,使培養液的活菌生物含量大幅提高,為創傷弧菌疫苗的產業化生產提供了理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基 FJ03-X2菌株為本室保存的創傷弧菌;平板培養基 TSA(W/V)(p H7.0):大豆胨0.3%,胰蛋白胨1.7%,NaCl 1.5%,K2HPO40.25%,葡萄糖 0.05%,瓊脂 1.5%,0.7×105Pa濕熱滅菌20 min。

鑒別培養基TCBS瓊脂(購自杭州微生物試劑有限公司),取82g溶于1 000m L純水,加熱至完全溶解,冷卻至50℃,傾注無菌平皿備用。

種子(基礎)培養基 TSB(W/V)(p H7.0):大豆胨0.3%,胰蛋白胨 1.7%,NaCl 1.5%,K2HPO40.25%,葡萄糖 0.05%,0.7×105Pa濕熱滅菌20 min。

1.2 培養方法 從新鮮鑒別培養基 TCBS接種一環單菌落于50m L種子培養基 TSB中,搖床(28℃,180r/min)培養16h;根據試驗設計,從種子瓶接種至培養液搖床(轉速180r/m in)培養后,測定結果。

1.3 分析方法 p H值的測定:梅特勒-特利多320型p H測定儀。

細菌計數和OD595值測定:平板培養基 TSA涂布法活菌計數和紫外分光光度計(上海天美UV 1102)測定 OD595值。

生物量的測定:稱量干凈離心管,取20m L培養液至離心管內10 000 r/m in離心10m in,倒干上清液再稱重,由前后的質量差與原體積之比即為生物量。

2 結 果

2.1 菌株中后期生長曲線 采用平板涂布方法進行活菌計數 ,在培養時間 16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、72h各取一次樣。做出菌株的中后期生長曲線如圖1所示。從圖1可知,當培養時間達到20～28h左右時,菌種生長基本處于穩定期,28h菌數峰值近80×108cfu/m L;32h之后細菌進入衰老死亡期,72h菌數僅為1.25×106cfu/mL。

圖1 FJ03-X2菌株中后期生長曲線Fig.1 The growth curve of strain FJ03-X2

2.2 菌株數量與(10×)OD595的關系 稀釋菌液,分別測定菌液的(10×)OD595值與數量(108cfu/mL),得出活菌數量與(10×)OD595值的相關關系(圖2)。圖2顯示活菌數量與(10×)OD595值基本呈線性關系,添加趨勢線可以換算出細菌數量與(10×)OD595值之間的函數公式,函數公式為:y=0.0768x+0.0761,其中 y代表(10×)OD595值;x代表細菌數量(108cfu/m L)。

圖2 FJ03-X2活菌數量與(10×)OD595值的關系Fig.2 The curve of strain FJ03-X2 between quan tity and(10×)OD595

2.3 培養溫度 經不同溫度培養細菌并進行細菌性能試驗,結果顯示適宜培養溫度為28℃(另文報道)。

2.4 培養初始p H值 在基礎培養基 TSB組成不變的前提下,將培養基的初始p H值分別調節為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,然后接種培養。采用細菌(10×)OD595值間接測定培養液中的活菌含量,p H值對菌株FJ03-X2的影響如圖3所示。由此可知,該菌最適生長p H值為7.0～7.5。

圖3 培養基pH值的確定Fig.3 The effects of pH value on the growth of strain FJ03-X2

2.5 接種量 在基本培養條件前提下,改變接種量,使接種量分別為 0.10%、0.50%、1.00%、5.00%、10.00%,采用(10×)OD595值間接測定培養液中的細菌數量。接種量與培養液細菌數量(10×)OD595值的關系如圖4所示,結果表明不同接種量對創傷弧菌的培養影響不顯著,綜合考慮,適宜接種量為10%。

2.6 溶氧對生長的影響 溶解氧是需氧菌培養的必備條件,搖瓶裝液量的多少直接影響氧的傳遞。本實驗在基本培養條件前提下,改變裝液量,使裝液量分別為:200/500 m L(鋁箔和牛皮紙),200/500 mL(八層紗布),100/500 m L(鋁箔和牛皮紙),100/500 m L(八層紗布),50/250 mL(鋁箔和牛皮紙),50/250 m L(八層紗布);25/250 mL(八層紗布),然后接種培養。同樣采用(10×)OD595值間接測定培養液中的細菌數量。菌株FJ03-X2對氧氣的需求情況如表1所示。從表中可知,裝液量為25/250 mL(八層紗布)時,培養液中的細菌(10×)OD595值最高;結果顯示,菌株FJ03-X2是需氧型。

圖4 接種量對菌體生長的影響Fig.4 The effects of inoculum size on the growth of strain FJ03-X2

表1 溶氧對菌體生長的影響Tab.1 The effects of oxygen on the growth of strain FJ03-X2

2.7 培養基優化

2.7.1 碳源的優化 基礎培養基的碳源葡萄糖分別配制為 0.05%(對照)、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%,制成培養基后接種培養,用(10×)OD595值間接測定培養液中的細菌數量并測定p H值,結果見圖5。從圖中可以看出,細菌數量與產物p H值波動趨勢幾乎完全一致,葡萄糖(p)對創傷弧菌生長影響比較敏感,最適合創傷弧菌 FJ03-X2生長的碳源是 0.2%葡萄糖;當葡萄糖為 0.4%、0.8%、1.6%時,培養液中的細菌(10×)OD595值明顯偏低、產物p H值也異常低。

2.7.2 氮源的優化 基礎培養基中的胰蛋白胨分別設為 1.7%(對照)、1.2%、0.8%、0.4%和大豆胨0.6%、0.3%(對照)、0.15%以及 200%TSB(但氯化鈉保持1.5%);結果(見表2)顯示胰蛋白胨(y)和大豆胨(d)含量與細菌(10×)OD595值呈正相關關系;但200%TSB細菌(10×)OD595值不高,說明配方之間有比例因素。

圖5 碳源對培養的影響Fig.5 The effects of carbon on the growth of strain

表2 氮源對菌體生長的影響Tab.2 The effects of nitrogen sourceson the growth of strain FJ03-X2

2.7.3 無機鹽的優化 基礎培養基中磷酸氫二鉀分為 0.25%(對照)、0.1%、0.05%,細菌 (10 ×)OD595值分別為 0.555、0.547、0.533;結果顯示:不同濃度的碳酸氫二鉀的培養基培養FJ03-X2,細菌(10×)OD595值差異不明顯。

2.7.4 生長因子的優化 玉米漿和酵母膏均富含生長因子,本實驗是在基礎培養基上添加玉米漿和酵母膏,研究其對菌株 FJ03-X2的生長促進作用;試驗分組為分別添加酵母膏 0.25%、0.10%、0.05%、玉米漿 0.25%、0.10%、0.05%、空白對照(未添加),細菌(10×)OD595值分別為 0.516、0.500、0.491、0.520、0.509、0.523、0.484;從結果可知,添加玉米漿(y)和酵母膏(j)均能促進細菌生長,細菌(10×)OD595值均比空白組(即未添加)顯著增加;酵母膏含量與細菌(10×)OD595值呈正相關關系,可能與酵母膏本身蛋白含量高也有關系;其中玉米漿的最佳添加量為0.05%。

2.7.5 正交實驗 培養基中各組分之間有一定的內在關系,為尋找它們之間最恰當的配比,在研究了碳源、氮源、無機鹽和生長因子等單因子對菌株FJ03-X2生長的影響以后,采用正交實驗的方法研究這些因素對菌株生長的綜合作用,以進一步完善培養基中各組分的功能,提高培養液的生物量。以葡萄糖(0.18%、0.20%、0.22%)、胰蛋白胨(1.2%、1.5%、1.8%)、大豆胨(0.2%、0.4%、0.6%)和玉米漿(0.2%、0.4%、0.6%),磷酸氫二鉀 (0.15%、0.20%、0.25%)、氯化鈉(1.0%、1.5%、2.0%)、磷酸鐵 (0.0005%、0.001%、0.002%)和酵母膏(0.05%、0.1%、0.2%)作為培養因素,每個因素各選取三個水平,并按L9(34)正交表設計9組搖瓶培養實驗,每組做兩個平行。正交實驗的因素與水平和實驗結果分析見表3。

表3 正交實驗結果分析表Tab.3 The resultsand statistic analysis table of orthogonal trial

由實驗Ⅰ極差可知,A的極差最大,C的極差最小;由實驗Ⅱ極差可知,D的極差最大,F的極差最小。極差越大,反映該因素水平變動時,總指標變化越大,也就是該指標對綜合指標的影響越大。因此,按極差大小順序排列為A>B>D>C;H>G>E>F。據表2可知,菌株 FJ03-X2最佳培養基配方為A2B3C2D2E2F3G3H3。并通過優化 TSB培養基培養創傷弧菌生物量高達50 mg/mL以上;而對照組基礎TSB培養基培養生物量約為25 m g/m L。

3 結 論

由實驗可知,培養基的初始p H值、溶氧狀況和培養基的組成等對菌株的生長有很大的影響。適合創傷弧菌FJ03-X2菌株生長的最佳條件是:培養基初始p H值為7.0,接種量10%(相對搖瓶裝液量),培養溫度28℃,裝液量25m L/250 mL。通過單因子分析和正交實驗,確定出創傷弧菌 FJ03-X2優化培養基主要成分為:葡萄糖2g/L、胰蛋白胨18g/L、大豆胨4g/L和玉米漿4g/L。通過優化培養基培養創傷弧菌生物量可實現翻番,為疫苗大規模生產奠定了物質基礎。采用20L發酵罐補料培養24-28h,結果生物量可高達100-150 mg/m L。

〔1〕Cerdaá-Cue?llar M,Permin L,Larsen JL.Comparison of selective media for the detection of Vibrio vulnificus in environmental samples〔J〕.Journal of App lied Microbiology,2001,91:322-327.

〔2〕Biosca E G,Amaro C,Esteve C,et a1.First reco rd of Vibrio vulnificus biotype 2 from diseased European eel,Anguilla anguilla〔J〕.J Fish Dis,1991,14:103-109.

〔3〕許斌福,陳秀錦,俞伏松,等.創傷弧菌 ISCOM疫苗的免疫學效應研究〔J〕.中國人獸共患病學報,2007,23(11):1075-1078.

〔4〕吳斌,盧中華.創傷弧菌感染的致病機制研究現狀〔J〕.中國急救醫學,2004,24(11):834-835.

〔5〕李寅,高海軍,陳堅.高細胞密度發酵技術〔M〕.北京:化學工業出版社,2006,(6):229.

〔6〕許斌福,林天龍,董傳甫,等.鰻鱺創傷弧菌的分子鑒定〔J〕.中國人獸共患病雜志,2005,21(11):995-998.

Optim ization on fermentation of Vibrio vulnif icus FJ03-X2

XU Bin-fu,CHEN Xiu-jin,L IU Xiao-dong,L IN Neng-feng,L IU Xin-hua,L IU Jing-yu,L IN Tian-long
(Institute of B iotechnology,Fujian Academ y of A gricultural Sciences,Fuzhou 350003,China)

The effects of culture condition and media on the grow th of strain Vibrio vulnificus FJ03-X2 were studied in the experiment.The optimized fermentation conditions were as below:28℃,7.0 p H value of medium,10%inoculum size,50 mL medium per flask(250 mL),and 180r/m rotate.The optimized fermentation culture medium for strain FJ03-X2 was obtained after analyzing the effects on single elements of themedium(carbon sources,nitrogen sources,mineral and grow th facto r,respectively)for the grow th of strain and the relationship between each element.Themost optimal prescription for fermentation was composed of 0.2%glucose,1.8%tryp tone,0.4%soya pep tone and 0.4%co corn steep liquo r.The highest biomass concentration obtained in the experiments was above 50 mg/mL.

Vibrio vulnificus;fermentation;op timize

S941.42

A

1002-2694(2010)11-1008-04

＊國家863項目(2006AA 100308);福建省科技重點項目(2008N 0023);農業部公益行業專項(nyhyzx07-043);福建省自然基金項目(2008J0057);福建省水產病害防治技術工程研究中心項目(2009N2003)

林天龍,Email:lint05@163.com

1.福建省農業科學院生物技術研究所,福州 350003;

2.福建省疾病預防控制中心,福州 350001

2010-05-25;

2010-09-01