高效液相色譜法測定利塞膦酸鈉的含量

萬維香，瞿建江

（江蘇省泰州市人民醫院，江蘇 泰州 225300）

高效液相色譜法測定利塞膦酸鈉的含量

萬維香，瞿建江

（江蘇省泰州市人民醫院，江蘇 泰州 225300）

目的建立測定利塞膦酸鈉含量的高效液相色譜法。方法色譜柱為漢邦C18柱（250 mm×4.6 mm,5!m），流動相為緩沖液（含5 mmol/L磷酸二氫銨、2 mmol/L四丁基溴化銨、1.5 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，用氫氧化鈉調節pH至7.2）－甲醇（75∶25，v/v），流速為1 mL/min，檢測波長262 nm。結果輔料及中間體對樣品測定不產生干擾，利塞膦酸鈉質量濃度在4.2～37.8!g/mL范圍內與峰面積有良好的線性關系，平均回收率為100.5%，RSD為1.1%（n=9）。結論該法可以用于利塞膦酸鈉的含量測定。

利塞膦酸鈉；含量；高效液相色譜法

利塞膦酸鈉(sodium risedronate)用于治療骨質疏松，可有效抑制骨吸收、改善骨質結構，效果良好[1]。與其他雙膦酸鹽類藥物相比，利塞膦酸鈉具有高效、安全、服用劑量小等優點，有著良好的發展前景[2]。其常用的含量測定方法是采用有機破壞后比色法測定分子中磷的含量，再換算成利塞膦酸鈉的含量。筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測定了其含量，現報道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（美國），包括Waters1525泵、Waters2487檢測器、漢邦HB230A柱溫箱；Breeze色譜工作站。利塞膦酸鈉對照品（純度為86.3%，批號為 20080321）及樣品（批號為 20060601，20060602，20060603），均自制品；水為重蒸水（自制）；甲醇為色譜純（漢邦科技有限公司，批號為200605072），磷酸二氫銨，乙二胺四乙酸二鈉，四丁基溴化銨，氫氧化鈉。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：漢邦 C18柱（250 mm×4.6 mm，5!m）；流動相：緩沖液（含5 mmol/L磷酸二氫銨、2 mmol/L四丁基溴化銨、1.5 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、用氫氧化鈉調節pH至7.2）－甲醇（75∶25，v/v）；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：262 nm；進樣量：20!L。在此條件下，色譜圖見圖1。理論塔板數按利塞膦酸鈉峰計算不低于4 000。

2.2 溶液制備

取利塞膦酸鈉對照品適量，精密稱定，加流動相制成每1 mL含利塞膦酸鈉20!g的溶液，即得對照品溶液。取利塞膦酸鈉樣品適量，精密稱定，加流動相制成每1 mL含利塞膦酸鈉20!g的溶液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

空白干擾試驗：分別精密吸取2.2項下溶液及空白輔料溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖（圖1）。結果表明溶劑及空白輔料溶液對利塞膦酸鈉含量測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：精密稱取利塞膦酸鈉對照品適量，用流動相溶解，制成質量濃度分別為 4.2，12.6，21.0，29.4，37.8!g/mL 的對照品溶液。精密吸取上述溶液各20!L，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積。以峰面積（A）對質量濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程 A=11 019C －4 048.8，r=1.000 0（n=5）。結果表明利塞膦酸鈉質量濃度在4.2～37.8!g/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

回收率試驗：分別按已知樣品含量75%，100%，125%的量，加入利塞膦酸鈉對照品和處方配比的輔料于量瓶中，依法測定，記錄峰面積，計算回收率。結果見表1。

表1 回收率試驗結果(n=9)

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別于 1，2，3，5，10，20，30 h時進樣測定。結果峰面積的 RSD為1.1%（n=7），表明供試品溶液在30 h內穩定。

重現性試驗：對同一批（批號為20060601）樣品6份，依法測定。結果峰面積的 RSD為0.3%（n=6），表明方法重現性好。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液，重復進樣5次，測定峰面積，計算進樣精密度，結果的 RSD為1.0%。以不同試驗人、不同儀器對同一對照品及同一批（批號為20060601）樣品6份進行測定。結果的 RSD均小于2%，表明中間精密度良好。

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法測定含量，并與藥典中紫外分光光度法（UV法）[3]測定結果進行比較。結果見表2。可見，這兩種方法均可準確測定本品的含量，準確度良好。由于HPLC法準確度更高，因此最終采用其作為本品的含量測定方法。

表2 樣品含量測定結果

3 討論

取利塞膦酸鈉對照品適量，溶于流動相中,在紫外可見分光光度計上于200～400 nm波長范圍內掃描,結果在262 nm波長處有最大吸收。

利塞膦酸鈉分子結構中含有的親水基團較多，疏水基團較少,這就使得其在反相固定相上保留較弱、出峰較快；另外，由于兩個磷酸根基團在水溶液中均可發生解離，因此在流動相中利塞膦酸鈉實際上是以游離態和解離態多種形式存在，這是造成利塞膦酸鈉色譜峰形拖尾的原因之一。

由于利塞膦酸鈉在流動相中主要以陰離子的形式存在，因此采用與呈陽離子的離子對試劑形成離子對的方法，可以延長利塞膦酸鈉的出峰時間。參考文獻[1]選用溴化銨類試劑。試驗中發現，當色譜系統的其他條件一定時，利塞膦酸鈉的保留時間與離子對試劑的烴基鏈長呈正相關,即四乙基溴化銨對出峰時間的影響最小,四丁基溴化銨的影響適中,而十八烷基三甲基溴化銨的影響最大，最終選擇四丁基溴化銨作為色譜系統的離子對試劑。

文獻[3]中曾采用聚合物固定相、將流動相pH調至11～12來改善雙膦酸鹽類藥物的色譜峰形。本試驗考察了反相色譜柱在其耐受的pH范圍(即pH 2～8)條件下，利塞膦酸鈉色譜峰形與流動相pH之間的關系，發現流動相pH的提高對色譜峰形的改善作用并不明顯。利塞膦酸鈉與金屬離子有較強的絡合作用[4－5]。在試驗中發現，當向流動相中加入少量絡合劑乙二胺四乙酸二鈉時,色譜峰形可得到明顯改善。這可能與乙二胺四乙酸二鈉能減弱固定相上痕量金屬離子與利塞膦酸鈉的絡合作用有關。

[1]郝衛強,劉文英，狄 斌，等.高效液相色譜法測定利塞膦酸鈉片的含量[J]. 中國藥科大學學報，2001，32（4）：286 －289.

[2]Sir is ES,Chines AA,Altman RD,et al.Risedronate in the treatment of Paget′s disease of bone：an open label,m9lticenter st9dy[J].J B one Miner Res,1998,13(6)：1 032 － 1 038.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：化學工業出版社,2005：附錄191－193.

[4]Us9i T,Kawakami R,Watanabe T,et al.Sensitive determination of a novel bisphosphonate,YM 529,in plasma,9rine and bone by high performance liq-9id chromatography with fl9orescence detection[J].J Chromatogr B,1994,652(1)：67－72.

[5]Kwong E,Chi9 AM,McClintock SA,et al.HPLC analysis of an amino bispho sphonate in pharmace9tical form9lations 9sing postcol9mn derivation and fl9o recence detection[J].J Chromatogr Sci,1990,28(11)：563－566.

Determination of Sodium Risedronate by HPLC

Wan Weixiang,Qu Jianjiang
（Taizhou Municipal People's Hospital,Taizhou,Jiangsu,China 225300）

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of sodium risedronate.MethodsThe analysis was achieved by using Hanbang C18column with the buffer solution－ methanol(75∶25,v/v)as the mobile phase.The buffer solution was prepared by dissolving 5 mmol/L ammonium dihydrogen phosphate,2 mmol/L tetrabutyl ammonium bromide,1.5 mmol/L disodium ethylenediamine tetraacetic acid and adjusted to pH=7.2 with sodium hydroxide.The detection wavelength was at 262 nm,the velocity was 1 mL/min.ResultsThe sample was not interfered with materials and intermediates.The linear range was 4.2－37.8!g/mL(r=1.000 0).The average recovery rate was 100.5%,RSD=1.1%(n=9).ConclusionThis method can be used to assay the sodium risedronate.

sodium risedronate;content;HPLC

R927.2；R982

A

1006－4931(2010)04－0024－02

2009－09－02)