TNF-α對鼻咽癌放射增敏的體內實驗研究

熊 暉，孫 寧，袁 健，李飛虹，蔡瓊珍

1.廣東醫學院病理學教研室(廣東 湛江 524023) 2.廣東藥學院病理學教研室(廣東 廣州 510224)

放射治療是鼻咽癌首選治療手段，但鼻咽癌細胞存在放射敏感性異質性[1]。為提高鼻咽癌放射敏感性，尋找放射增敏劑提高鼻咽癌放療療效具有臨床意義。我室以往研究發現鼻咽癌放射敏感性差異與放射后引起細胞凋亡的能力不同等因素有關[2]。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)具有促進腫瘤細胞凋亡的作用，體外實驗中使鼻咽癌細胞放射敏感性顯著增高[3]。本實驗觀察TNF-α對鼻咽癌裸鼠移植瘤的影響，探討TNF-α體內對鼻咽癌放射增敏的作用及機制?，F報道如下：

1 材料與方法

1.1材料人低分化鼻咽癌CNE-2Z(WHO分型是分化型非角化性癌)及其兩個亞克隆株：具放射敏感潛能的CNE-2Z-H5及放射抵抗潛能的CNE-2Z-S1(以下分別簡稱H5、S1)由我室建立并保存[1]。BALB/c-nu小鼠由廣東中山醫科大學腫瘤防治中心SPF裸鼠室提供。

1.2主要試劑和儀器TNF-α由中國軍事醫學科學院提供。多聚賴氨酸購于武漢博士德，SP-9000免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、小鼠抗人單抗Caspase-3和Survivin購于北京中杉金橋生物技術有限公司。Thertron 78060Co機為加拿大生產，Olympus顯微攝像機。

1.3細胞培養及動物飼養CNE-2Z、H5和S1采用含10%小牛血清的RMPI 1640培養液(內含青、鏈霉素各100 U/ml)，置于37℃恒溫培養箱中培養備用。裸鼠鼠齡為1～2個月，體質量15～25 g，雌雄兼用，在凈化繁殖室的SPF環境中，于隔離室恒溫環境的承流架中飼養，飼以滅菌的水和飼料。

1.4裸鼠移植瘤放射增敏實驗用無血清RPMI 1640制成每0.2 ml含1×106個細胞懸液，用7號針頭注入0.2 ml于裸鼠右后肢腓腸肌皮下，每種細胞株接種7只裸鼠。當移植腫瘤直徑長至1 cm左右，各組移植腫瘤體積無統計學差異時，照射前用戊巴比妥鈉腹腔注射，使動物進入輕度麻醉狀態，采用Thertron 78060Co機用10 Gy單次照射。距離80 cm，劑量率80.54 cGy/min，總吸收劑量10.47 Gy，時間13 min。照射部位為裸鼠右后肢移植腫瘤處，充分暴露在射野范圍內，其他部位周圍用鉛塊遮蔽。實驗分兩批共6組，第一批：CNE-2Z+放射組(CNE-2Z+R)、H5+放射組(H5+R)、S1+放射組(S1+R)。第二批：S1+TNF-α組、S1+生理鹽水+放射組(S1+NS+R，生理鹽水與TNF-α等容積)、S1+TNF-α+放射組(S1+TNF-α+R)，每組7只裸鼠。用藥方法：TNF-α 100 000U/只裸鼠，用微量注射器直接注入瘤體局部，12h后拿去照射。按免疫缺陷動物常規飼養，定期用毫米游標卡尺測量各組移植瘤體積變化。計算增敏率，增敏率=(1-實驗組腫瘤體積/對照組腫瘤體積)×100%[3]。各組治療后第7周采用頸椎脫位法處死裸鼠，對皮下移植瘤及相應肺、淋巴結進行取材，4%中性甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色觀察，計算肺臟、淋巴結轉移率，在各組裸鼠移植瘤HE切片中隨機選取5個高倍鏡視野，觀察每個視野核分裂數(mitotic index，MI)，計算平均值(個/HP)。采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件比較各組移植瘤壞死組織的面積百分比。

1.5免疫組織化學染色將各組裸鼠移植瘤切片進行免疫組織化學染色，按照SP試劑盒說明書進行，所用抗體的工作濃度均為1∶100。試驗中以已知陽性組織為陽性對照，PBS 代替一抗作為空白對照。由兩人分別獨立對實驗結果進行雙盲法評估。結果判斷：無陽性表達細胞或陽性細胞數<5%為陰性(-)，>5%為陽性(+)。每一例陽性切片在顯微鏡下隨機選擇3～5個200×倍視野(每例計數約1000個細胞)，保持相同的拍攝條件，用Olympus顯微攝像機拍攝圖片(1360×1024像素)，采用圖像分析軟件Image pro Plus 6.0測量陽性表達腫瘤細胞的累積光密度(integrated optical density，IOD)。

1.6統計學處理實驗數據資料統計采用統計學軟件 SPSS 15.0進行獨立樣本t檢驗，單因素方差分析(One-Way ANOVA)和χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CNE-2Z亞克隆株裸鼠體內放射敏感性異質性10Gy照射后H5組腫瘤生長較慢，S1組較快，CNE-2Z組居中。照射后第1周～6周S1組腫瘤瘤體較CNE-2Z、H5組大，逐步呈現該趨勢但無統計學意義，自第7周始S1組與H5組瘤體體積比差異顯著(P<0.01)(見圖1)。

2.2 TNF-α對S1細胞的裸鼠體內放射增敏S1裸鼠移植瘤在3種不同方法處理后，S1+TNF-α+放射組的腫瘤生長體積較小，S1+生理鹽水+放射組次之，S1+TNF-α組體積較大，S1+TNF-α+放射組與S1+TNF-α組、S1+生理鹽水+放射組與S1+TNF-α組比，差異均有統計學意義(P<0.01)，但S1+TNF-α+放射組腫瘤生長體積與S1+生理鹽水+放射組比較差異無統計學意義。與S1+TNF-α組相比，S1+生理鹽水+放射組和S1+TNF-α+放射組的抑瘤率分別為45.28%和67.68%，組間比較差異有統計學意義(P<0.01)。S1+TNF-α+放射組放射增敏率為37.65%(見表1)。各組裸鼠移植瘤生長曲線數據擬合，S1+TNF-α+放射組腫瘤生長體積較為接近放射后CNE-2Z組(見圖1)。

表1 TNF-α對S1裸鼠移植瘤放射增敏的影響(n=7,%)

各組間比較，P<0.01。

圖1 各組裸鼠移植瘤腫瘤體積

2.3裸鼠移植瘤組織壞死程度、核分裂指數、肺轉移率和淋巴結轉移率各組裸鼠移植瘤鏡下組織學類型都是分化型非角化性癌，瘤體中央都出現片狀壞死。放射后H5組裸鼠移植瘤組織中壞死明顯，CNE-2Z、S1組與H5組比壞死較少。放射后CNE-2Z、S1組核分裂指數均大于放射后H5組(P<0.05/0.01)。H5組裸鼠移植瘤放射后有2例肺轉移和1例淋巴結轉移，CNE-2Z組有1例淋巴結轉移，S1組有1例肺轉移，三者組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。單獨TNF-α處理的S1裸鼠移植瘤組織壞死面積為(45.25±13.19)%，S1+生理鹽水+放射組和S1+TNF-α+放射組裸鼠移植瘤組織壞死分別為(59.80±8.53)%和(58.84±22.82)%，與單獨TNF-α處理組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，但S1+生理鹽水+放射組與S1+TNF-α+放射組比較差異無統計學意義(P>0.05)。S1+生理鹽水+放射組和S1+TNF-α+放射組的核分裂指數低于單獨TNF-α處理S1組(P<0.05)，肺轉移率及淋巴結轉移率亦均低于單獨TNF-α處理S1組，但差異無統計學意義(P>0.05)；S1+生理鹽水+放射組與S1+TNF-α+放射組比較剛無明顯差異。見表2。

2.4 Caspase-3和Survivin在各組裸鼠移植瘤組織中的表達Caspase-3定位于細胞漿，少數在胞核表達或胞漿、胞核均有表達。各組裸鼠移植瘤組織中Survivin均表達于細胞漿。免疫組織化學染色半定量分析顯示，S1+TNF-α+放射組裸鼠移植瘤細胞胞漿中Caspase-3表達稍高于S1+生理鹽水+放射組與S1+TNF-α組，差異無統計學意義(P>0.05)；S1+TNF-α+放射組裸鼠移植瘤細胞核中Caspase-3表達高于S1+TNF-α組(P<0.05)，但與S1+生理鹽水+放射組比較無明顯差異(P>0.05)。各組裸鼠移植瘤組織均有6例Survivin陽性表達，各組間Survivin的IOD值無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表2 各組裸鼠移植瘤組織壞死程度、核分裂指數、肺轉移率和淋巴結轉移率

與S1+TNF-α組比，*P<0.05；與H5+R組比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

表3 S1裸鼠移植瘤中Caspase-3和Survivin表達

與S1+TNF-α組比，*P<0.05

3 討論

鼻咽癌是對射線較為敏感的腫瘤，但放療后總的5年生存率僅為50%左右。研究發現，腫瘤細胞群中出現放射抵抗的細胞亞群是鼻咽癌放療失敗的主要原因之一。尋找有效的放療增敏劑，制定具有針對性的放療方案，有助于提高放射治療的效果。

我們通過裸鼠移植瘤試驗觀察到10Gy照射后第7周S1組與H5組瘤體體積比差異顯著，瘤組織中壞死、肺轉移率和淋巴結轉移率較H5組少，核分裂指數顯著大于放射后H5組，再次證實鼻咽癌細胞CNE-2Z存在放射敏感性異質性，體內實驗也證實S1細胞是具有放射抵抗潛能的亞克隆株。隨后以S1為主要研究對象，用3種不同方法處理S1裸鼠移植瘤，發現S1+TNF-α+放射組和S1+生理鹽水+放射組的腫瘤生長體積均小于S1+TNF-α組，瘤組織壞死均大于S1+TNF-α組，差異有統計學意義。S1+TNF-α+放射組和S1+生理鹽水+放射組核分裂指數、肺轉移率及淋巴結轉移率均低于單獨TNF-α處理S1組，但差異無統計學意義(考慮為樣本數量較小所致)，抑瘤率分別為45.28%和67.68%。以上結果表明TNF-α結合放射治療能有效抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤生長。

近年來，TNF-α及其相關凋亡誘導配體(TNF-α related apoptosis inducing ligand，TRAIL，也稱為Apo2L)在實體瘤凋亡中所起的作用使它成為潛在抗癌因子，采用基因或蛋白重組的TNF-α對某些腫瘤的放、化療增敏起到一定作用[4～6]。然而，有研究報道TNF-α對腫瘤具有雙重作用，既可殺傷腫瘤細胞引起腫瘤壞死，也可促進其生長和浸潤[7]。TNF-α對鼻咽癌放射敏感性的影響如何，目前較少見文獻報道。本實驗用TNF-α直接注入S1裸鼠移植瘤體局部，12 h后進行照射，TNF-α聯合放射治療組的增敏率為37.64%，但與等容積生理鹽聯合放射治療組相比，S1裸鼠移植瘤TNF-α聯合放射治療組中瘤組織壞死、核分裂指數、肺轉移率、淋巴結轉移率無明顯降低。實驗中S1裸鼠移植瘤TNF-α聯合放射治療組與容積生理鹽聯合放射治療組相比，存在著腫瘤生長體積和瘤組織壞死比例兩種結果的不一致，TNF-α聯合放射治療組腫瘤生長體積小，但瘤組織壞死相對少；且單獨TNF-α處理組的瘤組織壞死比例最小，結果提示TNF-α對鼻咽癌S1裸鼠移植瘤的作用可能為聯合作用而非放療增敏?？紤]到裸鼠體內移植瘤實驗增敏率的計算，沒有體外細胞實驗的增敏比率(sensitization enhancement ratio，SER)這一指標精確，TNF-α在鼻咽癌放射治療中的作用較為復雜，有待進一步研究探討。

放射治療的主要機制是誘導腫瘤細胞凋亡，腫瘤對放療誘導的凋亡產生抗拒是放射治療失敗的原因之一。TNF-α是一種由單核-巨噬細胞分泌的細胞因子，能抑制某些腫瘤細胞生長。TNF-α引起的經典凋亡信號傳導通路是激活半胱氨酸天門冬氨酸特異蛋白酶-3(Caspase-3)，最終使DNA斷裂，細胞發生凋亡。Caspase-3屬半胱氨酸蛋白酶家族，是凋亡反應的最終效應蛋白酶，測定Caspase-3能反應凋亡的程度。有學者[8]采用免疫組化方法檢測52例放療前鼻咽癌，結果顯示5年以上復發組Caspase-3表達高于3年以下復發組，推測Caspase在一定程度上是反映鼻咽癌放療敏感性和預測鼻咽癌放療效果的重要指標。Survivin是1997年由Ambrosini[9]等從人類基因組文庫中篩選克隆出來，是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)家族的成員之一，分子量約16.5 kD。Survivin具有強大的抗凋亡活性，是Caspase-3的直接抑制劑，通過其殘基與Caspase-3結合，可以抑制TNF-α和輻射誘導等因素引起的腫瘤細胞凋亡。已有研究表明，具有放射抵抗性的腫瘤細胞Survivin呈高表達，并可影響腫瘤細胞的凋亡，可作為與腫瘤放射敏感性的預示指標[10～12]。本實驗檢測了3種不同方法處理后S1裸鼠移植瘤組織中Caspase-3和Survivin的表達，結果顯示，S1+TNF-α+放射組裸鼠移植瘤細胞胞漿中Caspase-3表達與S1+生理鹽水+放射組、S1+TNF-α組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；胞核中Caspase-3表達高于S1+TNF-α組(P<0.05)，但與S1+生理鹽水+放射組比較無明顯差異(P>0.05)，提示在鼻咽癌裸鼠移植瘤放射治療中，TNF-α對瘤細胞漿中無活性的Caspase-3表達影響不大，可能是影響胞核中Caspase-3的表達來抑制S1裸鼠移植瘤生長，Caspase-3在胞核中的表達可能較胞漿表達更好地反映放射誘導的鼻咽癌細胞凋亡程度。S1+TNF-α組、S1+生理鹽水+放射組和S1+TNF-α+放射組裸鼠移植瘤中Survivin的IOD值無明顯差異差異，表明三組不同方法處理的S1裸鼠移植瘤放射敏感性無明顯變化，提示TNF-α可能通過非放射增敏機制作用于鼻咽癌裸鼠移植瘤。因裸鼠移植瘤實驗為小樣本事件，且腫瘤增敏涉及增敏藥物的濃度、作用時間和具體操作等細節問題，TNF-α對鼻咽癌是否存在放療增敏尚需進一步研究證實。

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