微藻的固定化技術及應用研究▲

賀 敬 李 壯 王英娟 馬 濤 蔣海亮(西北大學生命科學學院,陜西西安市 710069)

微藻的固定化技術及應用研究▲

賀 敬 李 壯 王英娟3馬 濤 蔣海亮(西北大學生命科學學院,陜西西安市 710069)

微藻;固定化;應用前景

微藻作為當今研究的熱點,具有生長速率快、油脂產量高、碳水化合物和其他營養成分豐富的優點,可用于生物制藥、生產生物柴油、提取必需脂肪酸、激光醫療和污水處理等領域[1]。但由于微藻個體微小,常規的生物技術很難應用于微藻,而微藻的固定化技術恰恰解決了這一問題。固定化技術使微藻在污水處理、吸收富集營養、種質保藏、代謝物生產等方面的能力大大提高[2]。現對微藻的固定化技術的方法及其應用研究綜述如下。

1 微藻的固定化方法

微藻固定化技術主要有吸附法、包埋法、偶聯法[3～5]三種方法 ,見表 1。

1.1 吸附法 微藻細胞可通過靜電吸附結合在固相載體表面。固相載體表面可形成單層和多層的微藻細胞層。由于,這種固定化技術操作簡便,成本低廉,因此得到了廣泛的應用。被固定的微藻結合的強度不一,固定微藻經常容易脫離進入培養液中,而培養液中懸浮微藻細胞也可吸附在固相載體表面,形成動態平衡。由于,該方法操作簡單而常被用于微藻細胞的固定,但微藻細胞的截留量卻因吸附載體不同而受到限制[6]。

吸附法常用的固相載體包括纖維素載體 (如二乙氨乙基纖維素、鋸末、脫木素鋸末等)和無機載體 (如坡縷石、高嶺石、水云母、多孔瓷器、多孔玻璃等)。這些固相載體往往還需進行表面修飾以增強對微藻的吸附力,如玻璃、纖維素薄膜等載體則可經聚陽離子、殼聚糖或者其他化學物質的表面修飾后,用于微藻細胞的固定。

1.2 包埋法 包埋法是將微藻細胞截留在水不溶性的凝膠絡合物的網絡空間中,通過聚合作用,或通過離子網絡形成,或通過沉淀作用,或改變溶劑、溫度、pH值使細胞截留[7]。此方法具有高的保留容量,對細胞無毒性,但操作方法復雜[8]。包埋法常用的載體有:瓊脂、藻酸鹽、交叉菜糖、骨膠原、果膠等。

1.3 偶聯法 具有多個相同功能基團的偶聯劑,通過與微藻細胞表面的基團反應,從而使微藻細胞相互連接呈網狀結構而達到固定的目的[9]。用此方法固定的微藻細胞不易流失,操作簡單,但由于固定過程的劇烈反應,對微藻細胞產生一定的毒性,影響微藻細胞活力。常用的偶聯劑有戊二醛、異氰酸、氨基硅烷、碳化二亞胺等。

就目前而言,微藻固定的三種方法中,吸附法和包埋法具有操作相對簡便、成本較低、對細胞傷害較小等優點而常被采用。但吸附法細胞保留量較小,所以包埋法成為目前最為廣泛應用的固定方法,而且包埋載體又以藻酸鈣或 K2交叉藻聚糖較為適宜。

表 1 幾種固定方法的比較

2 固定化對微藻的影響

微藻經固定后,生活環境的改變會對微藻細胞造成一定的影響。首先,固定微藻所用的樹脂、高分子聚合物等有機載體對微藻細胞有一定的毒性[10],影響正常的細胞活力。其次,與自由懸浮培養的微藻相比,固定化的微藻具有一個較長的停滯期,當停滯期過后,固定化的微藻才會呈現出與自由懸浮培養的微藻細胞相似的生長曲線[11]。此外,固定化微藻形態會因固定化而受到一定程度的影響。Lukavsky等[12]比較了固定的 S.quadricauda、C.kessleri和其游離懸浮培養的形態,發現C.kessleri細胞的大小和形狀未發生顯著變化,但細胞器變得更多,開始出現淀粉粒;而 S.quadricauda出現了更多的異型細胞[12]。

固定之后,藻類的生長和生理特性發生了變化,可以提高對氮、磷和重金屬等物質的吸收和富集。但是目前這方面的研究還很不系統,一般認為固定化提高了藻類的合成代謝活性,延遲衰老,并在一定程度上降低了藻類的分解代謝活性。

3 微藻固定化培養的應用

3.1 在傳統的微藻懸浮游離培養中細胞增殖較快,但形成的次生代謝產物的量較少。相反,固定化培養不僅能使細胞生長速度減慢,便于營養物質,轉化為次生產物,而且 a2海藻酸鈉固定的微藻中可檢測到類苯基丙烷復合物,這是非常重要的結果。

3.2 種質保藏 藻種長期較好地保藏可大大節省人力和物力,固定化技術可作為微藻種質保藏的重要方法之一[13]。Chan等[14]將 S.quadricauda、I.galbana用鈣 -海藻酸鈉包埋,在無培養基、4℃、暗光的環境中保存 3年后,將微藻細胞用新鮮培養基復蘇,發現細胞依然具有活性,在四周內增殖了40代。Hertzberg等[15]用鈣 -海藻酸鈉包埋 P.tricornutum細胞,在暗光、4℃下保藏 1年,將其復蘇后,微藻可釋放氧氣。Lukavsky等[16]用 2%的瓊脂固定了 31種原核和真核微藻,在低溫下保藏一年后,大多數仍具有代謝活性。Joo等[17]用鈣 -海藻酸鈉固定了 D.bardawil,C.minutissima,P.lutheri and H.pluvialis四種微藻,得到了比游離培養基更高的細胞密度。胡蓓娟等[18]對 8種微藻采用固定化和低溫弱光 2種方法進行保存作了比較,發現只有三角褐指藻、藍隱藻和小球藻較適合固定化保存。由此可見,固定化微藻的保種技術在某些藻類是可行的。

3.3 產生能源 氫氣由于具有熱值高、來源廣泛、無污染的優點,因此是一種優良的燃料。生物合成氫氣相比化學合成更環保、能源消耗更少[19]。一些微藻可在脅迫條件下產生氫氣,如綠藻在缺少硫元素的時候由于不能合成光反應中關鍵蛋白而產生氫氣[20,21]。因此,利用包埋法將微藻固定在特定脅迫條件的培養環境中,即用于產生氫氣。Melis等[22]通過兩步法在硫饑餓的培養條件下,間接光解制氫,基于固定化技術的培養條件使產氫量遠高于一般的培養方法。有報道等[23]比較兩種延長固定化硫饑餓微藻細胞 Chlamydomonas reinhardtii產氫時間的方法后發現,將固定化的微藻細胞交替置于高硫和低硫的培養環境中,可延長微藻的產氫時間。

3.4 脫氮除磷 利用富營養污水培養微藻,在提供了微藻生長所需的營養的同時,也降低了水體中氮磷的含量,從而使污水得到了凈化,但這種培養系統占地面積大,成本高,微藻從中分離出來需離心過濾,耗時耗力。固定化微藻由于固定化載體對氮磷具有一定的吸附富集作用,對環境等的變化具有一定的緩沖作用,同時固定化微藻與自由懸浮微藻相比較,顯示出更強的增長性和生理活性,使得固定化微藻具有處理效率高、對 pH值、溫度、有毒物質和有機溶劑等環境變化承受能力強等優點[24,25],常被用于微藻培養的脫氮除磷中。Canizares等[26]對懸浮螺旋藻和角叉菜聚糖固定螺旋藻處理造酒廢水進行了比較研究,懸浮藻對 NH4+2N、PO4

3-2P和總磷的去除率分別為 75%、98%和 53%,而固定藻對氮、磷的去除率均在 90%以上。王瑞旋等[27,28]將固定化波吉囊藻和微綠球藻引入凡納對蝦的養殖環境中,發現波吉囊藻對氨氮的吸收能力較強,而固定化微綠球藻對亞硝酸鹽的吸收力較強。Aguilar等[29]分別培養殼聚糖固定的海洋藍藻 Synechococcus和游離的 Synechococcus,用于吸收水體中的氮元素和磷元素,發現前者的吸收效率遠高于后者。

3.5 去除重金屬離子及其他污染物 重金屬元素進入環境后,不僅造成資源浪費,更能造成嚴重的環境污染,對人類自身安全產生持久的威脅。重金屬廢水的傳統處理方法主要有離子交換法、化學沉淀法、電解法、反滲透法、吸附法、不溶性絡合物法、氧化還原法、蒸發濃縮法等[30,31]。這些方法技術要求較高,而且費時費力,容易造成二次污染。微藻固定化技術在增加單位體積生物量、提高處理負荷的同時,減少了解吸過程中微藻的損失量,并且固定化載體對重金屬離子具有吸附富集作用,對其毒性具有緩沖作用,從而使得固定化微藻具有更高的處理效率和吸附量[32],在去除重金屬離子及其他污染物方面優于傳統處理方法。Ergene等[33]通過褐藻酸凝膠固定綠藻 Scendesmus quadricauda,用來去除水環境中的亮藍顏料,發現在初始亮藍燃料濃度為 150 mg/L、pH 2.0、30℃時,固定化的微藻具有非常高的吸收效率。嚴國安等[34,35]利用褐藻酸鈉固定化的斜生柵藻對 Hg2+的去除率明顯高于懸浮藻,并且污水中 Hg2+的濃度大小對于 2種狀態斜生柵藻的去除率也有一定影響。

3.5 毒性檢測 由于微藻細胞高的比表面積,使其對環境中不同的污染物具有較高的敏感性,因此在水污染監測中,微藻成為了一種重要的檢測工具,也得到了美國環保署、國際經合與發展組織、國際標準化組織等的認可[36,37]。目前,已將固定化微藻引入環境監測,提高了檢測的準確性和應用范圍。Pandard等[38]用小球藻 Chlorella vulgaris和柵藻 Scendes mus subspicatus構建了在水相系統中工作的氧電極系統,發現除草劑非常敏感,與基于傳遞介質的系統在長時間的操作中具有更高的靈敏度。Detmar等[39]采用了萊茵衣藻 Chlamydomonas reinhardtii構建了光纖 pH的生物檢測器,用來測定 pH值的變化,可用于環境中有毒化合物的早期監控。Maria等[40]將月牙藻 Selenastrum細胞固定在 2%的瓊脂中,可以通過檢測 pH的變化來測定重金屬 Cr6+的量。

4 展 望

目前,固定化技術已經在污水處理、次生代謝物生產、種質保藏、環境檢測、污水脫氮除磷、產生能源等方面展現出可喜的能力,借助微藻固定化技術,有可能早日突破實現微藻生物電池因為微藻的密度小、生長持續時間短、體積大等缺點而未能投入實際應用的瓶頸,服務于我們的社會。同時在固定的藻類細胞中,質粒具有良好的穩定性,可以降低突變的產生[41],使得微藻固定化技術應用于分子生物學領域具有一定的前景。雖然,固定化微藻已用于實際的污水脫氮除磷,但是由于目前微藻固定化技術的不完善,受到固定化材料的造價較高、沒有開發出成型的固定化微藻傳感器等[42]因素限制,還不適用于大規模的廢水處理,其用于污水的生物處理和環境的生物監測方面還處于試驗室研究階段,有待于今后不斷地努力和技術的革新,將微藻固定化推向廣闊的應用實踐中。

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R 943.1

A

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