漆酶改性高木素含量的硫酸鹽漿，提高紙的強度特性——在沒食子酸的條件下用漆酶處理

漆酶改性高木素含量的硫酸鹽漿，提高紙的強度特性
——在沒食子酸的條件下用漆酶處理

在高-K（91）硫酸鹽漿中，漆酶與沒食子酸發生化學反應。與未處理的試樣相比，處理后的耐破、抗張、濕強分別增加34%、20%和72%。而漆酶對全漂漿沒有大的影響，這就表明木素是對纖維處理的主要對象。結果表明紙頁強度的提高是由于纖維間氫鍵結合的改善和產生苯氧自由基縮合作用的結果。

引言：

木質纖維素化學是處理過程和影響最終產品特性的主要因素。對于每一種漿料，由于樹種不同，制漿和抄紙條件不同，賦予他們不同的物理和化學特性。因而要使獲得的產品有很高的質量，對于工藝和制紙化學來說是一個挑戰。為了生產出高質量的產品，生產者有許多濕部化學品供選擇以達到獲得不同紙張性能的目的。除化學藥品外，酶由于他們對纖維、半纖維、木素和抽出物有特殊作用效果，而引起了研究人員的關注。

研究表面纖維素酶是由于它能夠提高紙漿的物理性能和濾水性能。半纖維素酶主要由于其可以提高化學纖維的可漂性。果膠酶可以提高紙機上的留著率。脂肪酶和脂酶可以與抽提物反應，進而減少紙機上脂肪沉淀，從而進一步完善紙漿的流程。近來的研究主要集中在通過改變纖維化學以改變紙的特性，并且在用漆酶（苯二酚：氧氣氧化還原酶）處理改變漿料纖維特性上已經取得了進展。漆酶是一種多銅氧化酶，它可以通過催化氧化作用使氨基苯酚、多聚酚、多聚氨、某些無機離子和芳基肼發生改變，同時將氧氧化成水脫除。由于對漂白階段漆酶可能進行的反應已進行了徹底的研究，目前對漆酶進行研究的焦點已經轉移到對漿中纖維的改變。

一種推測認為：漆酶由于體積過大而不能接近漿中纖維壁內的木素。存在于高得率硫酸鹽漿表面的木素的有效總量為漆酶自然反應的對象。Felby等研究人員已經在用漆酶處理毛山櫸漿提高中厚纖維板的性能作了全面的研究。他們的研究成果表明：漆酶使纖維表面產生酚氧自由基，從而達到使纖維板性能改變的作用。Wang和Viikuri各自的研究成果表明：漆酶的應用可以在提高機械漿和高的率硫酸鹽漿的物理性能方面起到有益的影響。Huttermann等研究人員的研究表明：漆酶具有使木素磺酸鹽活化的能力，從而使木素磺酸鹽可以與纖維間生成不可逆的鍵合。Yamaguchi等研究人員能夠提高熱壓合成結構的干強和濕強。這種脫氫化合物被假定在紙張結構內引起疏水黏合劑的作用。近來，Chandra和Ragauskas致力于高得率硫酸鹽將在水溶性酚化合物作用下漆酶的不同作用的一系列研究。

在4-羥基苯甲基存在下用漆酶處理高得率硫酸鹽漿可以提高纖維表面的羧酸，改進纖維表面物質的摩爾質量，處理后的纖維制成的紙頁耐破和抗張強度有一定的提高。提高漿的高錳酸鉀值和表面羧基含量，結合對木素的典型研究，表明4-羥基苯甲酸通過漿內木素上苯氧自由基聯合使漿改變。Lund等研究人員已經證明，中介體化合物存在可以催化漆酶脫木素，從而使濕強顯著提高。推測漆酶/中介體共同作用下在木素纖維素機體內生成游離基，它可以形成共價鍵，從而提高濕強。依據目前的研究，用漆酶和沒食子酸（3，4，5-三羥基苯甲酸）與高卡伯值的硫酸鹽漿反應，研究表明：與用4-羥基苯甲酸處理相比，漆酶的反應速率較快，漆酶和沒食子酸在漿的特性方面的影響是使未打漿和經過打漿處理的漿的干強、濕強均提高。

原料和實驗方法：

化學制品：沒食子酸（3，4，5-三羥基苯甲酸）由麥迪遜，WI Sigma-Aldrich化學公司提供；

氫氧化鈉；

氫氧化鈣和硫酸；

漆酶由Novozymes Biotech,Raleigh,NC提供。

本次試驗采用的漆酶為從Trametes villosa提取到的NS51002。

紙漿：從坐落于美國東南部的商業公司購得的針葉完全三段漂硫酸鹽漿。漿在處理前，試樣被稀釋到1%的濃度（漿的質量+水的質量），用0.05N的NaOH調pH至10并保持30min以除去溶于堿的木素。之后用大量水洗滌商業漿至濾液的pH呈中性無色。

酶活：依據Sealey等人提出的測定漆酶氧化紫丁香醛聯氮速率的方法。測定在100Mm磷酸鉀緩沖溶液中，每毫升酶液和0.216Mm紫丁香醛聯氮反應過程中A530mm處吸光值的變化。該測試在23℃，pH4.5條件下進行。

打漿：依據TAPPI標準T248om-85，將漿樣打漿。打漿后，漿樣用VWR Scientific417過濾，24～40μm和更大的物質被保留。試樣分成8部分用于不同的實驗。漿的處理：未打的和打完的漿板、全漂后的未打漿按表1所描述的方法處理。隨后的反應以20%的濃度在Kapak袋內進行。攪拌混合物，并將pH調到4.5，加入0.200mL漆酶/g漿（以絕干漿計）(8.54*106U/g漿)后將槳浸于 45℃水浴中。將混合后的漿反應4h，這是因為已有的結論表明，反應4h可使酚基最大程度結合。反應后，用去離子水洗滌至濾液澄清并顯中性。在沒食子酸共同作用下用漆酶處理漿，其反應后的酶活應為反應前的20%～30%。處理后，試樣同樣被過濾，并洗滌至濾液無色且pH呈中性。先前的研究結果表明：對照漿內氮含量與經過酶處理后洗滌至濾液澄清且pH呈中性（用水接近20L）的漿相似。依據Scanllan將漿內所有的雜離子轉化為Ca2+形式。其過程大致為：從1%試樣濃度懸浮溶液，用0.1N H2SO4將pH調至2.75，攪拌試樣30min后用去離子水徹底洗凈，再將試樣配制成1%濃度的懸浮液，用Ca(OH)2將pH調至10,攪拌30min后用去離子水徹底洗凈。處理后的漿按TAPPI標準T205om-88制成手抄片。未打漿在抄片前先打散50000轉。由合并標準偏差后的漆酶和278μmol沒食子酸/g漿處理漿，重復三次反應過程得到t-值，進而得知漿在濃度95%區間內的最小偏差值。依據TAPPI方法236，用KMnO4滴定漿測得該硫酸鹽漿的木素含量，并以“卡伯值”表示。該值是木素含量的直接測量方法，%木素含量=0.15*k值。

羧基的測定：羧基的測量方法在其它文章中已有描述。所采用方法的機理是質子化的羧酸基團與碳酸氫鹽反應生成二氧化碳和水。釋放出二氧化碳的量可用來確定已知數量漿內的羧基的數量。方法為：取1g漿樣在1%的濃度下，用0.1000M HCl在室溫下處理1h，用濾水過濾，用1L蒸餾水洗滌，風干。稱取50mg風干漿樣，加入到裝有4.00mL濃度為0.00500mol/L碳酸氫鈉標準溶液的小瓶中，馬上密封并放在盤上用HS-GC測定。所有的測定在HP7694自動樣品器和HP-6890型帶有熱導檢測器的氣相色譜儀中測定。氣相色譜條件：毛細管直徑為0.53mm，毛細管長30m，溫度30℃，載體氮流動速度3.1m/min。樣品器的條件：烘箱溫度60℃，由氦氣提供壓力的時間為0.2min；放置試樣圈消耗時間0.2min；試樣平衡0.05min；將小瓶平衡10min,同時不斷使其劇烈搖晃；圈消耗1.0min。

紙張測定： 分別根據TAPPI方法T210、T494、T414和T403，測得緊度、抗張強度、撕裂強度和耐破度。根據TAPPI T456測定濕強度，即將試樣完全浸入水中5min后測定。

紫外光譜：在Perkin-Elmer的固體試樣放置處放上分光計，同時放射出紫外光譜。根據TAPPI T1214sp-98，將手抄片切成2.2*2.5cm2的紙條，用十層[厚度限制為：層數的增加不會改變對光（R∞范圍）的吸收]通過測其反射比（R∞）來測量。將手抄片垂直放置于待測樣放置的位置，并通過用所有光譜照射對照樣（未處理和經過打漿處理的漿制成的手抄片）獲得對照樣的射頻頻譜。

表1 用漆酶和沒食子酸處理漿

接觸角∶前進接觸角的測量是通過把一個15mm*100cm的紙條（光滑面朝上）用雙面膠帶粘貼在一個平臺上，平臺下面有一個注射器，在注射器前安有一臺PCHM575-2照相機。注射器、照相機均和電腦連接，以便于照相并進行圖像分析。注射器以10μm/s速度向紙頁注射經二次蒸餾的蒸餾水，每0.067s記錄一次圖像。當水珠在紙頁表面穩定并且勻稱時，就可以開始對畫面進行分析了。一般水珠在2～3個畫面（0.04～0.201s）后就穩定了。接觸角通過圖像畫面分析軟件經過分析而得出測量結果。

結果與討論

在改善木質纖維素性能的研究領域內，酶對纖維的作用已經成為一個重要的研究方向。并已發表了大量文獻。近期Chandra和Ragauska已著手于漆酶對高卡伯值硫酸鹽漿中纖維性能提高的研究，他們的研究主要集中在如何應用漆酶使木素上的酚基與纖維鍵合。目前，沒食子酸（圖1）由于其可以在一定菌類作用下加速漆酶反應而進行了大量研究。沒食子酸在漆酶的共同作用下，可促進高卡伯值硫酸鹽漿內纖維性能的提高。纖維的改變程度可以通過測定高木素含量纖維的機械性能和化學性能來衡量。

圖1 沒食子酸

用漆酶和沒食子酸共同處理未經打漿和經過打漿處理的高卡伯值硫酸鹽漿。同樣可運用卡伯值測定機理，已證明卡伯值可以作為表征酚酸與漿內纖維鍵合的有效方法。未打漿證明：在堿性條件下將未打漿的所有雜離子轉化為Ca2+形式后，用漆酶和沒食子酸（用量276μmol/g漿）共同作用，可使卡伯值提高4%～5%。堿處理可以清除沒能與漿發生鍵合的低分子量的沒食子酸反應產物。提高沒食子酸的用量至1104μmol/g漿可使實際卡伯值最大提高14%～15%。羧基的測定與卡伯值測定的趨勢類似。在圖2中可見，羧基數量的增加與卡伯值的增加相一致。因此，為易于測定，以打過的漿用卡伯值來測定漆酶和沒食子酸對纖維的改變程度。

經過打漿處理的漿與漆酶和沒食子酸反應，來驗證是否經過打漿處理后，隨著纖維表面積的增加，可以促進漆酶作用下沒食子酸與纖維的鍵合。假定：打漿處理使木素與漆酶和沒食子酸的接觸面積增大，從而在反應過程中產生了大量的酚基的潛在結合點。但該結論與用漆酶和沒食子酸（276μmoil/g漿）處理經過打漿處理的漿和未經打漿處理的漿，所提高的卡伯值（經過打漿處理的漿，卡伯值提高5%～6%）相接近的結論相矛盾（圖3）。這表明：通過打漿使纖維表面積增大對漆酶作用下沒食子酸與漿鍵合并無顯著影響。通過手抄片的紫外光譜圖擴散反射率測得的漆酶和沒食子酸處理后在纖維組織內產生的變化進一步驗證了這一結論。

圖2 卡伯值和羧酸基的測定。用漆酶和沒食子酸處理未經打漿處理的高-K漿后的測定結果 （羧酸LSD=7.1μmol/g漿，卡伯值LSD=3.1）

圖3 用漆酶和沒食子酸處理經過打漿處理的高-K漿后，卡伯值的測定結果（卡伯值LSD=2.57）

本次試驗采用與實驗結論相似的紫外光譜圖的方式，通過吸收作用可以在聚氨基葡糖照片軟片上觀測到，鉻氨酸酶和苯磷二酶產物在視覺范圍（400～800nm）呈現出顯著增加。在漆酶作用下的未打漿內增加沒食子酸的加入量，在可見光區域內可觀察到染成棕色的手抄片對光吸收的響應變化 （圖4）。為揭示漆酶和沒食子酸作用是否與漿內纖維表面的變化有直接聯系，用水在手抄片上測定其接觸

圖4 用漆酶和沒食子酸處理未經打漿處理的高卡伯漿所制成的手抄片的吸收曲線。每個試樣均減去未經處理的對照樣所測得的值

接觸角測定結論與Hodgson等研究人員用硫酸鹽漿測得的結論相似(圖5)。它與用漆酶和沒食子酸（276μmol/g漿）反應后漿的接觸角的區別很小。在照片上觀測到滴在沒食子酸超過276μmol/g漿制成的手抄片上的水在0.067s內就被吸收了，這說明沒食子酸超過276μmol/g漿所制的手抄片不能用這種方法測定。這些結論也與漿連接lgal（漆酶沒食子酸）水溶性反應產物可增加其親水性這一觀點相吻合。正是由于高卡伯硫酸鹽漿纖維表面化學變化的緣故，使得研究其表面化學的變化對紙頁物理性質的改變十分有意義。

圖5 用漆酶和沒食子酸處理未經打漿處理的高-K漿所制成的手抄片的接觸角的測定。誤差線經10次測試合并標準偏差。

經過打漿處理或沒經過打漿處理的漿所制成的手抄片，在經過漆酶和沒食子酸共同處理后，將離子轉化為Ca2+的形式。Burzy等人研究表明,增加全漂化學漿表面的酸根能夠使紙張強度提高。這一強度的提高是由于氫鍵結合的增加和纖維的潤脹。表2顯示的是經過打漿處理和未經過打漿處理的漿所制成的手抄片的緊度。從表3可以看出，在兩種情況中，用漆酶和沒食子酸處理對高卡伯值漿的緊度影響是最低的。

表2 用漆酶處理經過打漿處理和未經打漿處理的漿，所制成的手抄片的強度

表3 在用漆酶、沒食子酸處理未經打漿處理的高卡伯值硫酸鹽漿的過程中，提高沒食子酸的濃度所獲得的結果。

和緊度相似的是撕裂度也沒有太大變化。而未經打漿處理的漿經過漆酶和沒食子酸處理后，耐破強度比未處理過的對照樣提高了34%；經過打漿處理的漿經漆酶和沒食子酸處理后僅提高了10%。這些結果意味著，在漆酶、沒食子酸處理的手抄片中纖維結合更緊密了。經過打漿處理的漿用漆酶和對羥基苯甲酸處理后其耐破度增加10%，未經過打漿處理抗張強度提高了20%。值得注意的是已有研究表明，用漆酶處理酚類化合物以提高紙張強度，或是用單體酚或用漆酶與木素磺酸聚合形成的DHP來處理熱磨機械漿，并且必須經過熱壓榨來提高紙張的強度。而在目前的研究中，用漆酶處理漿料的同時加入沒食子酸，可以使漿料不經過熱壓就可以提高紙頁的強度。

就這一點而言，漆酶與沒食子酸作用的機理值得進一步研究。先前的研究結果表明，沒食子酸氧化反應中產生七種氧化產物，而每一種產物的親水性均比沒食子酸本身要強。在目前的研究中，用漆酶和沒食子酸反應產物完全是水溶性的，其它的酚酸 （如丁香酸）和漆酶反應的氧化產物是非水溶性的。在用漆酶處理過程中它會促進酚類化合物連接到纖維上，但連接上疏水物質也許會阻礙纖維結合。表3中顯示了增加沒食子酸用量對紙頁強度的影響。從這些結果中可以看出增加沒食子酸的用量對抗張強度和耐破度有不利影響。雖然用漆酶和沒食子酸處理能增加纖維的親水性，但是沒食子酸用量過多會阻礙纖維間的鍵合。這也許是由于高用量的沒食子酸帶來大量陰離子并沉積在纖維上，這樣會阻礙纖維結合而不是有利于纖維間氫鍵的鍵合。

為了解釋纖維木素在漆酶和沒食子酸的處理過程中是否是必要的，我們采用全漂漿料做對照。表4的結果表明，對于漂后的漿料經過處理后羧酸含量有一定提高。當沒食子酸用量為278μmol/g漿時，對照樣羧酸增長量為26μmol/g漿，而高-K值漿料增長量為42μmol/g漿。這就說明，高卡伯值漿料中木素在漆酶和沒食子酸的處理過程中是必要的。漆酶處理的漂白漿料中加入少量沒食子酸，漂白漿的抗張強度沒有太大變化（表4）。

從漂白漿處理的結果來看，漆酶和沒食子酸處理后，減少了漿料中木素碎片，從而提高了抗張和耐破強度。對于抗張強度的測量使我們可以了解到漆酶、沒食子酸處理使強度增加的機理。經過漆酶、沒食子酸處理后干、濕強度增加可能是通過連接酚基，使漿料中形成了憎水性的化合鍵連接。

表4 用漆酶和沒食子酸處理全漂漿的測定結果

圖6 用漆酶和沒食子酸處理經過打漿處理和未經打漿處理的高-K漿，所制成的手抄片濕強的測定（濕抗張強度LSD=0.21N.m/g）

經過漆酶、沒食子酸處理后，測定試樣其抗張強度增加了72%（圖6）。這是因為漿中木素和漆酶反應后，在木素纖維基表面形成了基團。Lund和Felby用漆酶和介體及漿的抽出物處理未漂硫酸鹽漿，結果干強度有所提高。他們認為，使抗張強度的提高是由于在紙頁中形成了交錯連接的基團。與Lund和Felby研究結果不同的是，本文研究的結果是干、濕強度均有提高。

濕抗張降低是因為在纖維氫鍵結合點上，由于吸水而導致膨脹破裂。在目前的情況下，圖7中顯示的干、濕強度的比例中，用漆酶和沒食子酸處理，及用漆酶單獨處理對濕抗張強度均有明顯的提高，這就意味著出現了憎水性連接。這個結果顯示出用漆酶處理未經打漿處理的漿后，其濕強度均有所提高。同樣對于干抗張強度來說，增加沒食子酸用量，對于濕抗張強度并沒有有利影響。

圖7 用漆酶和沒食子酸處理經過打漿處理和未經打漿處理的高卡伯漿的干強與濕強的比率。

Lund和Felby用漆酶處理高卡伯值硫酸鹽漿，經過熱壓后，濕強度有顯著提高。而目前的研究中，漆酶處理后，干、濕強度均有所提高，研究加熱和加壓對于紙頁的影響是十分有意義的。干壓能夠提高紙張結構中鍵合面積，而濕壓只能夠增加紙頁的密度。干壓能夠使紙頁密度由0.33g/cm3增加到0.67g/cm3(對濕壓榨后紙頁而言)，而對濕壓的紙頁而言，在處理過程中密度可以忽略（圖8）。

圖8 使用漆酶、沒食子酸，用不同方法處理未經打漿處理的高-K漿經干壓或濕壓后與對照樣相比，其干強增長幅度的比較。

用漆酶處理或者漆酶和沒食子酸處理后，再干壓，干抗張強度有一定的提高。以前的研究表明低鍵合的漿料（如濕壓后的高得率硫酸鹽漿），當鍵合有了微小的增加，對于紙張抗張強度的影響是明顯的。而高鍵合的（干壓的紙頁）增加鍵合對抗張強度的影響不明顯。在目前的研究中，漆酶和沒食子酸對于抗張強度的有益影響被干壓榨抵消了。

圖9 使用漆酶、沒食子酸，用不同方法處理未經打漿處理的高-K漿經干壓或濕壓后與對照樣相比，其濕強增長幅度的比較。

對所有試樣來說，干壓榨可以使濕抗張強度有顯著提高。而在干壓榨后，由于漆酶和沒食子酸(276μmol/g漿)處理使濕抗張強度有明顯增加（圖9）。漆酶處理和漆酶、沒食子酸處理相比更適合于干壓榨。這一結果和Felby和Lund的觀察結果是一致的。

2010－7－28

王飛 趙溫波 裴繼誠編譯自：Biotechnol prog 2004,20,255-261

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