冬棗貯藏期病害病原菌的鑒定

摘要：對(duì)冬棗貯藏期引發(fā)黑斑病、漿胞病和輪紋病的9株真菌菌株進(jìn)行了分子水平鑒定。采用結(jié)合病原物形態(tài)特征和rDNAITS區(qū)序列特點(diǎn)的方法對(duì)獲得的菌株進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)，冬黑2(DH2)、冬黑4(DH4)、冬漿3(DJ3)、冬漿4(DJ4)、輪紋3(LW3)和輪紋5(LW5)在PDA培養(yǎng)基與玻片上均產(chǎn)生孢子；輪紋4(LW4)有明顯產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及橢圓形到卵網(wǎng)形單細(xì)胞的分生孢子；冬黑4(DH4)、冬漿3(DJ3)、冬漿4(DJ4)和輪紋5(LW5)產(chǎn)生磚格狀分生孢子；冬黑1(DHl)和冬漿5(DJ5)經(jīng)處理和誘導(dǎo)后仍不產(chǎn)孢。以ITsl和ITS4為引物，對(duì)9株真菌的基因組進(jìn)行擴(kuò)增。得到約550 bp左右的ITS區(qū)rDNA片段。將測(cè)序結(jié)果登陸GenBank進(jìn)行BLAST分析，依據(jù)Neighhor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。形態(tài)與分子鑒定結(jié)果表明，供試的9個(gè)菌株中，冬黑4(DH4)、冬漿3(DJ3)、冬漿4(DJ4)和輪紋5(LW5)為鏈格孢屬(Alternarta spp.)；冬黑1(DHl)和輪紋4(LW4)為擬莖點(diǎn)霉屬(Phornopsis spp.)；冬黑2(DH2)為莖點(diǎn)霉屬1種(Phoma sp.)；輪紋3(LW3)為嘴突臍蠕孢種(Exserohilum rostratum)；冬漿5(DJ5)為匍柄霉屬1種(Stemphylium sp.)。

關(guān)鍵詞：冬棗；病害；形態(tài)特征；ITS序列分析；鑒定

中圖分類號(hào)：S665.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-9980(2010)03-422-05

冬棗(Zizyphus jujuba Mill.cv.Dongzao)果形美觀，甜脆爽口，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是深受人們喜歡的優(yōu)良鮮食果品，有著廣闊的市場(chǎng)前景。近年來，通過對(duì)山東、天津、河北、山西和陜西等冬棗主栽區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，冬棗貯藏期因病原物潛伏侵染和采后侵染引發(fā)的病害主要表現(xiàn)為黑斑病、漿胞病和輪紋病3種，造成冬棗劣變損失，有的地區(qū)冬棗發(fā)病率為20％～50％，嚴(yán)重制約了冬棗產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前報(bào)道這3種病害的病原物都是依據(jù)形態(tài)特征做出的初步鑒定，供試材料均采摘于山東省內(nèi)。由于地域性的不同造成病原物變化的多樣性，越來越引起研究者的重視：目前冬棗采后病害的研究主要集中在防治方法的探索上，未見從分子水平上對(duì)該果實(shí)采后病原菌的鑒定報(bào)道。為了系統(tǒng)地研究冬棗采后病害的病原物種類，我們對(duì)不同地區(qū)采集的冬棗貯藏期病原菌進(jìn)行分子水平上的鑒定，確定它們的分類地位，以期為有效地防治冬棗采后病害提供一定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病原菌的分離

研究于2007—2008年連續(xù)2a的10月中旬，采集山東、天津、河北、山西和陜西等主栽區(qū)冬棗，貯藏期發(fā)現(xiàn)冬棗主要發(fā)生黑斑病、漿胞病和輪紋病3種病害。選取典型癥狀病果，經(jīng)70％乙醇表面消毒和無菌水沖洗后，在病健交界處挑取小塊果肉組織，接種在PDA培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)，觀察記錄病原菌的種類和數(shù)量。

1.2 回接侵染試驗(yàn)

純化后的真菌和細(xì)菌分別配成濃度為lxl0⁶孢子·mL^-1和1×10⁹cfu·mL^-1的懸浮液，不產(chǎn)孢的真菌用打孔器取直徑7mm的菌體接種。選取無病害的半紅冬棗果實(shí)，2％的次氯酸鈉浸泡3min后用無菌水沖洗。接種分有傷和無傷2種方式(不產(chǎn)孢的真菌以菌體覆蓋果實(shí)接種)，有傷采用接種針刺傷果實(shí)，接種20μL懸浮液，無傷采用浸泡的方法，每個(gè)處理均以無菌水作對(duì)照。處理后的冬棗果實(shí)放置于相對(duì)濕度約95％的塑料盒中，于20℃條件下貯藏，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率，并對(duì)病斑再分離。每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20個(gè)果實(shí)。

1.3 形態(tài)特征鑒定

根據(jù)供試真菌在PDA培養(yǎng)基平板及玻片上培養(yǎng)的菌絲及孢子形態(tài)進(jìn)行分類鑒定㈣。

菌絲生長(zhǎng)速率及菌落形態(tài)：用直徑5mm的打孔器在菌落邊緣選取菌齡一致的菌餅接種于PDA平板中央，28℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)，每隔24h測(cè)量一次菌落直徑。培養(yǎng)5d后照相記錄不同菌株菌落形態(tài)。每一處理設(shè)置4次重復(fù)。

孢子形態(tài)：在已接種培養(yǎng)4d的PDA平板上的菌落邊緣以40°～50°的傾斜角度插入已滅過菌的蓋玻片3～4片，置28℃黑暗培養(yǎng)4d后，將蓋玻片取出，以無菌水為負(fù)載劑制片觀察，即可觀察到菌絲及孢子著生的狀態(tài)，記錄其產(chǎn)孢的形態(tài)特征，同時(shí)拍照記錄。每處理設(shè)置4次重復(fù)。對(duì)于產(chǎn)孢的菌株，每菌株選取30個(gè)成熟孢子進(jìn)行大小測(cè)量，記錄結(jié)果。

1.4 ITS序列分析

1.4.1 DNA的提取 將玻璃紙剪成比直徑培養(yǎng)皿內(nèi)徑稍小的圓形，滅菌后鋪在事先倒好凝固的PDA平板上，從已在PDA平板上生長(zhǎng)3d的菌落邊緣，用打孔器取直徑5mm的菌絲塊。接種到已鋪上玻璃紙的PDA平板中央，培養(yǎng)7d的菌落用小刀刮起，放人已滅過菌的EP管中待用。DNA的提取用CTAB(Cetyhriethylammonium Bromide)法(略改動(dòng)：用超聲波破碎6min，運(yùn)行／間歇：8s／2s代替液氮研磨)。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增和測(cè)序所用的引物為通用引物ITSl和ITS4，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。ITSl(18SrDNA和5，8SrDNA之間的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))和ITS4序列分別為5’-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3’和5’-TCCTCCGCTrAqTGATAT-GC-3’。擴(kuò)增體系40μL，依次加入下列試劑：ddH₂O30.4μL；PCR buffer(10x)4μL；ITSl(10mmol·L^-1)1.2μL；ITS4(10mmol·L^-1)1.2μL；dNTP(2.5 mmol·L^-1)2μL；Taq酶(5U·μL^-1)0.4μL；模板DNA0.8μL(20～50ng)。PCR(美國(guó)MJ Research公司PTC-200 PCR儀)擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性40s；50℃退火60s；72℃延伸60s：共運(yùn)行30cycles；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠，1xTAE電泳緩沖液，5V·cm^-1電壓，上樣5μL電泳檢測(cè)，并以不加模板DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物為陰性對(duì)照，DNA Marker指示分子量，凝膠成像儀觀察并照相。

1.4.3 擴(kuò)增產(chǎn)物純化檢測(cè) 用UNIO-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工生物工程公司)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物上樣4μL(1％的瓊脂糖凝膠，1xTAE電泳緩沖液，5V·cm^-1電壓)電泳檢測(cè)純化樣品的純度(通常以上樣2μL在凝膠成像儀紫外燈下觀察到整齊單一條帶即可達(dá)到測(cè)序要求)。

1.4.4 序列測(cè)定和系統(tǒng)進(jìn)化分析 經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物由華大基因生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定(美國(guó)PE公司的377型DNA測(cè)序儀)。正向引物ITSl(5’→3’)，反向引物ITS4(3’→5’)雙向測(cè)序，比對(duì)校正后得到完整序列。經(jīng)BioEdit軟件的Clastalw進(jìn)行Alignment后，再用MEGA version 4.0中的NJ(Neighbor-Joining)方法生成系統(tǒng)發(fā)育樹，用Boot-strap對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗(yàn)，1000次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的致病性

對(duì)分離到的93株病原菌株，經(jīng)回接侵染試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為冬黑1(DHl)、冬黑2(DH2)、冬黑4(DH4)、冬漿3(DJ3)、冬漿4(DJ4)、冬漿5(DJ5)、輪紋3(LW3)、輪紋4(LW4)和輪紋5(LW5)的9株病原菌表現(xiàn)為強(qiáng)致病性，有傷接種果的發(fā)病率為86％～100％，無傷接種果的發(fā)病率為46％～58％，且表現(xiàn)出與原棗果同樣的病害癥狀，從發(fā)病部位再分離病原菌與原接種菌一致，分離頻率均為100％。試驗(yàn)證明，這9株病原菌是引發(fā)冬棗貯藏期黑斑病、漿胞病和輪紋病的主要致病菌。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

DHI：菌落白色，呈放射狀擴(kuò)展，生長(zhǎng)速度中等。菌落背面乳白色到淺黃色，菌絲無色、透明；在PDA平板及蓋玻片上均未產(chǎn)孢(圖版-A，J)。

DH2：在PDA平板上，菌落表面白色，貼近培養(yǎng)基表面的部分為黑色，生長(zhǎng)速度中等。菌落背面黑褐色，邊緣未老熟菌絲白色、氈毛狀、致密、有隔膜；老熟后的菌絲呈黃色。分生孢子橢圓形至卵圓形，少數(shù)串生，淺褐色，單細(xì)胞，直徑7～13μm(圖版-D，M)。

DH4：菌落深灰色至黑色，氣生菌絲初灰白色，后轉(zhuǎn)為青褐色，培養(yǎng)基呈深青褐色近黑色。菌絲致密、褐色、透明、具隔膜。分生孢子梗直立、粗大、或作屈膝狀彎曲，呈褐色，具隔膜。分生孢子單生或短鏈狀串生，倒棍棒狀或近橢圓形，具縱橫隔膜，磚格狀；成熟分生孢子具4～7個(gè)橫隔膜，2～4個(gè)縱或斜隔膜，常有1～2個(gè)橫隔較粗，頂端具喙。孢身大小為50.0～77.0μm×30.0～55.0μm(圖版-G，P)。

DJ3：菌落灰綠色，菌絲茂密、生長(zhǎng)速度中等。菌絲淺褐色、透明、具隔膜。分生孢子梗多單生或少數(shù)簇生，直立或作屈膝狀彎曲，淺褐色至暗褐色，具隔膜；分生孢子卵形、近橢圓形或倒棍棒狀、串生、褐色、多胞、具有縱、橫隔膜，磚格狀，分隔處略有縊縮，頂端具喙；孢身大小為20.5～40.5μm×9.0～15.0μm(圖版B，K)。

DJ4：菌落褐色，菌絲茂密、生長(zhǎng)速度慢。菌絲淡褐色、透明、具隔膜。邊緣未老熟菌絲白色、氈毛狀、蓬松。分生孢子梗直立、淺褐色。分生孢子卵形、褐色、單個(gè)著生或串生于分生孢子梗上，多數(shù)具一個(gè)橫隔膜，19.0～38.0μm×x8.0～13.5μm(圖版-E，N)。

DJ5：菌落平展、白色，菌落背面深紅色，生長(zhǎng)速度中等。菌絲茂密、透明、具隔膜，產(chǎn)生赭紅色色素。在PDA平板上培養(yǎng)14d，經(jīng)紫外照射、無菌水沖洗、切割等處理后仍不產(chǎn)孢，后采用PCA、PSA培養(yǎng)基誘導(dǎo)均未產(chǎn)孢(圖版-H，Q)。

LW3：菌落黑色，呈輪紋狀往四周擴(kuò)展，邊緣菌絲白色，生長(zhǎng)速度中等。菌絲淡褐色、透明、具隔膜。分生孢子梗褐色，直立或頂端呈屈膝狀彎曲，末端稍膨大，長(zhǎng)可達(dá)150.0μm，寬5.0～8，0μm。分生孢子深褐色、長(zhǎng)紡錘形，少數(shù)稍微彎曲，末端細(xì)胞被顏色較深較厚的真隔膜隔開，中間具4～6個(gè)假隔膜，34.0～86.0μm×12.0～30.0μm(圖版-C，L)。

LW4：菌落白色，背面乳白色到淺黃色，生長(zhǎng)速度中等。菌絲茂密、呈放射狀往四周擴(kuò)展，中央菌絲較多。在PDA平板上培養(yǎng)7d后滿皿，14d后菌落上出現(xiàn)散生的黑色小顆粒狀子實(shí)體，并產(chǎn)生油滴狀液滴。子實(shí)體大小為125.0～245.0μmx84.0～150.0μm；分生孢子橢圓形到卵圓形，無色，單細(xì)胞，7.9～12.8μm×2.3～4.2μm(圖版-F，0)。

LW5：菌落深灰綠色，呈放射狀向四周擴(kuò)展，生長(zhǎng)速度比較快。菌落中央表面白色茸毛狀，有的菌落背面呈現(xiàn)輪紋狀。菌絲淺褐色、透明、具隔膜。分生孢子梗頂端稍膨大。呈屈膝狀：分生孢子呈長(zhǎng)鏈狀生長(zhǎng)，具3-7個(gè)橫隔膜，有的具縱隔膜或斜隔膜，喙長(zhǎng)不超過孢子長(zhǎng)度的1／3，孢身大小為24.4～41.0μm×10.0～14.0μm(圖版－I，R)。

2.3 序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

所有參試菌株均擴(kuò)增出分子量550bp左右的片段。比對(duì)結(jié)果顯示，參試菌株中LW3的序列最長(zhǎng)，為575bp；DH2最短，為515bp。所有參試菌株的ITSl／ITS4 rDNA序列相似性均大于50％，平均在80％左右，表明它們?cè)谧匀谎莼嫌幸欢ǖ挠H緣關(guān)系。據(jù)報(bào)道，同屬不同種間相似性明顯大于屬間相似性。DH4、DJ3、DJ4和LW5的序列相似性超過98％，其中DJ3和DJ4，擴(kuò)增出來的序列長(zhǎng)度均為541bp，個(gè)別堿基有差異，相似性為99％，可能為同一屬。DHl和LW4的序列長(zhǎng)度分別為556bp和554bp，相似性為99％，說明這2種菌的親緣關(guān)系非常近，是同一屬。DJ5、LW3和DH2相互間及與其他參試菌株間的序列同源性差異比較大，是不同的屬。

Renske等指出：供試的rDNA的ITS序列在與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)后.序列相似性≥99％，可以鑒定為相同種；序列相似性為95％～99％可以鑒定為同一屬。依據(jù)供試菌株和GenBank參比菌株的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

由系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出(圖1)，9個(gè)菌株中DH4、DJ3、DJ4和LW5與Alternaria屬菌株A.tenulesima和A.alternata，LW3與突臍蠕孢屬菌株E rostra-turn，DH2與莖點(diǎn)霉屬Phoma菌株P(guān).glomercaa，DHI和LW4與擬莖點(diǎn)霉屬Phomopsis菌株分別聚在一起，構(gòu)成統(tǒng)計(jì)學(xué)上有力支持的分枝，支持率均為100％。再結(jié)合菌落形態(tài)、分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)與大小，可以確定DH4、DJ3、DJ4和LW5為鏈格孢屬，LW3屬于嘴突臍蠕孢種E.rostratum，DH2屬于莖點(diǎn)霉屬1種，DHI和LW4為擬莖點(diǎn)霉屬。同樣的方法鑒定DJ5屬于匍柄霉屬1種(表1)。

3 討論

前人通過形態(tài)學(xué)的鑒定認(rèn)為，引起黑斑病的病原菌是鏈格孢菌(Alternaria sp.)。王太明等報(bào)道，冬棗漿胞病主要致病菌受生長(zhǎng)期間的氣候條件影響，在不同的年份分別分離到交鏈孢霉菌(Alternariasp.)和根菌索菌(Rhizomorpha sp.)2種不同的主要致病菌。季延平等分離到的冬棗輪紋病病原物有輪紋大莖點(diǎn)霉(Macrophoma kuwatsukaii)、細(xì)極鏈格孢(A.temdssima)、小穴殼屬1種(Dothiorella sp.)、殼梭孢屬1種(Fusicoccum sp.)、炭疽菌屬1種(Col-letotrichum sp.)、莖點(diǎn)霉屬1種(Phoma sp.)和擬莖點(diǎn)霉屬1種(Phomopsis sp.)。該研究只對(duì)大莖點(diǎn)霉進(jìn)行了回接試驗(yàn)，表明為冬棗輪紋病的致病菌，而對(duì)其他分離的病原物沒有進(jìn)行回接致病性測(cè)定。因此，前人與本研究的結(jié)果不同之處.可能是由于真菌鑒定時(shí)采用的方法不同所致：也可能與采摘試材冬棗時(shí)，不同的年份、不同的栽培地，其不同的生態(tài)環(huán)境造成冬棗果面病原物分布不同有關(guān)。這與王亞萍等的分析結(jié)果一致。

9種供試真菌均屬于半知菌類，種間種內(nèi)生物性狀變異較大。在菌種保存過程中發(fā)現(xiàn)，繼代會(huì)造成形態(tài)上不同程度的不穩(wěn)定性，特別是DH2和DJ5。具體表現(xiàn)為DH2繼代后經(jīng)過相同培養(yǎng)時(shí)間，菌落中營(yíng)養(yǎng)菌絲占的比例逐漸變大，產(chǎn)孢也變得困難，必須經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)或人為機(jī)械損傷誘導(dǎo)后才能產(chǎn)孢：DJ5則是繼代之后產(chǎn)色素能力逐漸減弱：有些菌株如DHl和DJ5卻不產(chǎn)孢，給鑒定工作造成很大困難。因此，僅靠傳統(tǒng)的形態(tài)分類鑒定待測(cè)菌株是不可靠的。本試驗(yàn)在形態(tài)分類的基礎(chǔ)上結(jié)合分子鑒定手段(rDNA-ITS序列分析)對(duì)9種供試菌株進(jìn)行了鑒定，提高了鑒定的可靠性和準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

研究結(jié)合形態(tài)特征和ITS序列分析，將采自我國(guó)不同地區(qū)的冬棗貯藏期黑斑病的病原菌鑒定為擬莖點(diǎn)霉屬1種(Phomopsis sp.)、莖點(diǎn)霉屬1種(Phoma sp.)和鏈格孢屬1種(Alternaria sp.)；漿胞病的病原菌鑒定為鏈格孢屬(AItemaria spp.)和匍柄霉屬1種(Stemphylium sp.)；輪紋病的病原菌鑒定為鏈格孢屬1種(Alternaria sp.)、擬莖點(diǎn)霉屬1種(Pho—mopsis sp.)和嘴突臍蠕孢種(E rostratum)。(本文圖版見封3)