香蕉腺苷酸核糖基化作用因子1(MaArf1)基因的克隆及序列結構分析

摘要：Arf(ADP-ribosylation factors)作為小G蛋白家族中的一類，在植物細胞的胞內運輸中起著重要的作用。從采后2d的香蕉(Musa accuminataL.AAA group)果實cDNA文庫中篩選到一條Arf基因，命名為MaArfl。序列分析表明，MoArfl在植物中是高度保守的。與水稻、苜蓿、馬鈴薯、小麥和擬南芥等物種中Arf基因的相似性都超過95％。并且MoArfl分別在24-31(序列為GLDAAGKT，Alf蛋白P結構域)，67-71(序列為DVGGQ，G’結構域)，126-130(序列為NKODL，G結構域)的氨基酸處也具有保守的GTP結合結構域。根據已獲得的cDNA序列設計引物，研究又獲得了該基因的基因組序列。對其結構分析發現，該序列全長1998bp，由5個外顯子和4個內含子組成。內含子序列中存在大量的重復序列，并且在第4個內含子中有一個完整的開放閱讀框。推測這些序列可能參與基因的表達調控，也可能與RNA水平上的可變剪接有關。

關鍵詞：香蕉(MusaaccuminataL.AAA group)；MaArfl；cDNA；基因組序列

中圖分類號：S668.1

文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980(2010)03-404-06

小G蛋白是一類區別于異三聚體G蛋白的單體鳥核苷酸結合蛋白。由于分子量較小(約為21～30ku)而得名。小G蛋白一般被分為5個家族，包括Ras、Rab、Ran、Rho和AIf。它們作為信號轉導中重要的分子開關，進化相當保守，與許多不同的調控因子和效應器分子相互作用，產生細胞功能的多樣性。Ran，Rab和Arf3個家族負責調控真核細胞內與生命物質運輸有關的細胞活動。其中，Ran調節核孔介導的RNA和蛋白質的運輸：Rab控制特殊囊泡的運輸：而Arf則與分泌系統中的囊泡出芽有關。

Arf(ADP-ribosylation factors)最初是在哺乳動物的細胞內發現的，它可以激活霍亂毒素的ADP-核糖基轉移酶。近年來，在植物中發現了越來越多的Arf家族基因，Arf在植物體內以活性和非活性2種狀態存在，當它在GTP酶激活蛋白(GTPase-acti-vating protein)的催化下與GTP結合時處于活性狀態，可以參與胞內一系列的信號傳遞等生命活動。而在鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange fac-tor，GEFs)的催化下，它選擇性地結合GDP進入非活性狀態。研究發現，Arf在生物體內這種GTP-結合狀態的循環改變，使其在植物的細胞極性生長和生長素極性運輸調節中起著重要的作用。

我們利用香蕉采后2d的果實eDNA為驅動子，采后0d的果實eDNA為檢測子。進行抑制差減雜交(substract hybrid，SSH)，篩選到一批在香蕉果實成熟早期上調表達的基因。其中一個398 bp片段經blast分析后發現可能為Arf家族成員。研究對MaArf1全長eDNA和基因組序列的克隆、基因結構進行分析，為探索該基因在香蕉果實成熟過程中所具有的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以中國熱帶農業科學院香蕉種植園(海南，澄邁)開花后100-120d的香蕉(M.acumintaL.AAA group cv.Baxi)為試材，選取發育正常的果-梳，采下后將其分為單果指。這些材料經1‰的次氯酸鈉溶液表面消毒后，在22℃恒溫下晾干，48h后將果實組織切成塊狀經液氮冷凍后存于-80℃冰箱(即采后2d果實)。

1.1.2 試劑 Taq DNA Polymerase和DNA回收試劑盒購自博大公司(BioDev)，其他試劑均購自Siga-ma公司。測序由上海生工公司完成。

1.2 方法

1.2.1 香蕉果實總RNA的獲得和cDNA第1鏈的合成

根據Wan等的方法提取采后2d的果實(包括果皮和果肉組織)的總RNA，根據Clonetech提供的SMART RACE eDNA Amplification Kit的說明書，將10ixg總RNA反轉錄為單鏈eDNA。

1.2.2 MaArf eDNA的克隆 根據經SSH得到的398 bD的Arf同源片段分別設計5’和3’eDNA末端快速擴增(RACE)引物，以采后2d的香蕉果實cD-NA為模板，獲得該基因的5’端和3’端的序列。5’RACE正向引物：TGATGGGCGAGCTlTAAGTCCTC(由SMART PCR cDNA Synthesis Kit提供的SMAR-THA寡核苷酸)；5’RACE反向引物GTGTTCTG-GAAGTAATGCCTC：3’RACE正向引物：CTGTG-GAGGCATTACTFCCAG；3’RACE反向引物：-CTC-CGAGATCTGGACGAGC

(由SMART PCR cDNASynthesis Kit提供的3’SMARTCDS引物IIA)：5’和3’的擴增片段插入到pGEM-T(Promega，Madison，WI，USA)載體中并轉入Escherichia coli DH5a，經PCR鑒定后的陽性克隆進行測序。得到拼接序列后設計1對引物獲得該基因全長。正向引物：GGCTCTCTGTGTTCGGCGCGG：反向引物：TAACC，CACACAGGTCACTC。擴增片段插入pGEM-T(Promega，Madison，WI，USA)載體中并轉入E.coliDH5a，經PCR鑒定后的陽性克隆進行測序。

1.2.3 MaArf基因組序列的擴增用改良的CTAB法提取香蕉葉片基因組DNA，用于目的基因DNA序列擴增。利用軟件PrimerPremier5.0在Arf基因氨基酸編碼區域外端設計引物。正向引物(forwordprimer)

為5’-CGCCATGGGGTACAATGGGGCT-CACGTTC-3’，反向引物(reverse primer)為5’-CGACTAGTTTAAGCCTTGCTGGCAATGTT-3’，為了后續實驗的進行，兩引物外端均設計了酶切位點以便克隆到表達載體中，框內堿基所示即分別為核酸內切酶NcoI和speI識別位點。

2 結果與分析

2.1 MoAtfl全長cDNA序列的克隆

將SSH文庫中398bp片段與兩末端擴增產物進行拼接。在NCBI上利用ORF Finder對拼接序列進行分析發現，該序列含有一個完整的開放閱讀框，編碼181個氨基酸。再根據拼接所得的序列在首尾設計兩條引物，從采后成熟2 d的香蕉果實單鏈eDNA中擴增到了該基因全長，命名為MaArf1(登錄號為FJ607303)。Nucleotide blast分析表明，MaArfleDNA與水稻(NM_001058211)、小麥(AY736124)、擬南芥(M95166)和玉米(CAA56351)中的同源基因有較高的一致性，并且該序列具有保守的GTP結合結構域P，G，G’(圖1)。

2.2 MaArfl推導的氨基酸序列的生物信息學分析

BlastX分析發現，MaArfl在氨基酸水平上和其他物種的同源基因表現出極高的一致性。和水稻、小麥、苜蓿、玉米中Arf的一致性分別為99.45％(AAP73857)，98.34％(AAU821 12)，99.45％(AAR29293)，97.79％(CAA56351)。而且與苜蓿和水稻中的Arf基因進化距離最近(圖2)。對其所編碼蛋白理化性質及亞細胞結構定位的預測結果表明，MaArf分子量為20623.6ku，等電點6.43，主要可能存在與胞質的線粒體內膜中，為穩定存在蛋白。

2.3 MaArfl全長基因組DNA序列的克隆

根據本實驗室已克隆到的MoArfl cDNA，設計編碼區特異引物，從香蕉葉片基因組DNA中擴增出一條特異條帶，約2000bp。經測序鑒定，其全長共1998bp(Genbank登陸號為FJ607304)。

2.4 MaArfl基因組DNA內含子分析

通過NetGene2在線分析網站，分析觀察內含子剪接位點(圖3)：發現供體和受體的剪切位點都有4個。經過將MoA rf／的基因組序列和cDNA序列比較發現，該基因序列共具有5個外顯子和4個內含子，其組成如圖4，剪切位點與信息學分析一致。其中最大一個內含子位于翻譯起始位點下游149-740 bp處，共有691個堿基。內含子序列中含有大量的重復序列和回文序列。

3 討論

目前，已經從水稻、擬南芥、馬鈴薯、小麥㈣、胡蘿卜等多種高等植物中克隆到Arf基因，但是對其在各物種中的生物學功能還不甚清楚。該基因家族高度保守，而各基因成員的生物學表現卻不盡相同，這說明Arf基因可能是一個植物生長不可或缺的基因。

本實驗室首次從香蕉采后早期果實的抑制差減文庫中克隆到MoArf1，作為一個全新的Arf家族成員，該基因在香蕉采后早期成熟過程(0～2d)中呈現上調表達。這說明MaArf1可能在香蕉果實的成熟過程中發揮作用。

任茂智等報道在陸地棉Y18中獲得了Arf1的基因組序列，并且發現該基因在轉錄水平上出現了可變剪接的現象。這種內含子和外顯子之間的替換剪接能夠導致蛋白質活性的改變，或者改變蛋白在細胞中的定位，或者影響RNA的穩定和翻譯的效率舊，從而可能造成基因功能差異的出現。本研究獲得了MoArf1的基因組全序列，該基因2／3的核苷酸序列為內含子，其中具有大量的反向重復序列和回文結構，其中第4個內含子中還包含有一個完整的開放閱讀框，它們可能對該基因的表達具有重要調控作用。這為研究MoArf1在轉錄水平上的修飾調控奠定基礎，也為進一步研究MoArf1在香蕉果實中的功能和作用提供前提條件。

《荔枝學》

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