龍泉1號天然三倍體枇杷的花粉形態及生活力

摘要：以龍泉1號枇杷的二倍體、天然三倍體株系為材料，應用掃描電鏡進行了花粉形態的分析，并通過FDA熒光染色法、醋酸洋紅染色、TTC法及離體萌發試驗對花粉生活力進行測定，利用田間正反交試驗，對其花粉在柱頭上的自然萌發以及花粉管的生長過程進行觀察。結果表明，(1)龍泉1號二倍體花粉屬于N₃P₄C₅類型，天然三倍體花粉有6種形態；(2)FDA染色表明15個龍泉1號三倍體枇杷株系的花粉生活力具有顯著差異，且其測定的花粉生活力最接近實際的離體萌發率；(3)不同倍性植株的花粉在柱頭中的生長主要取決于枇杷花粉的生活力，而與姆本的倍性關系較小，且花粉管在柱頭中為非勻速生長。

關鍵詞：枇杷；天然三倍體：花粉形態：花粉活力：花粉管

中圖分類號：S667.3

文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980f2010)03-391-06

枇杷系薔薇科蘋果亞科枇杷屬(EriobotryaLindl.)植物，是我國南方主要果樹之一。枇杷為水果淡季中的珍品，但種子多，可食率低是其最大的缺陷。因此，培育無核枇杷是果樹育種者的重要目標。一直以來，許多學者對此進行了大量的研究，最富有成效的研究是通過四倍體回交二倍體獲得三倍體及天然三倍體突變體篩選。

花粉和授粉受精是植物生殖發育的重要問題，也是探討多倍體諸多遺傳機理的切入點之一。而目前關于三倍體枇杷花粉國內外尚無相關研究報道。因此，我們在篩選獲得了多個無核、大果、優質、豐產的三倍體枇杷株系的基礎上，對龍泉1號的二倍體和15個天然三倍體株系的花粉進行了掃描電鏡觀察，并用FDA染色、醋酸洋紅染色、TTC染色及離體萌發4種方法對三倍體枇杷花粉的生活力進行測定；此外，還通過田間正反交，對枇杷不同倍性花粉在柱頭上的自然萌發以及花粉管的生長過程進行觀察，以期為進一步探討天然三倍體枇杷花粉的可育性及三倍體枇杷有性生殖過程中生殖核行為和胚胎發育研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

研究所用試材取自西南大學果樹學重點實驗室多倍體枇杷資源圃中的龍泉1號天然三倍體枇杷(Eriobotrya]aponicaLindl，)株系(編號見表1)，并取二倍體為對照。于晴天采集未開放花蕾收集花粉，用密封性良好的小瓶盛裝標記，于4℃冰箱內密封干燥保存。

1.2 方法

1.2.1 花粉形態觀察 用導電膠黏于樣品臺上，真空噴鍍儀內噴金，在日立S-450型掃描電子顯微鏡下觀察，工作電壓25kV；選取有代表性的視野分900×(整體圖)和3000×(個體，赤道面)進行拍攝，每種取20粒花粉，在數碼照片上利用CAD軟件測量極軸P及赤道軸E的長度，計算平均值；并觀察記錄各花粉的外壁紋飾特點和萌發器官。

1.2.2 花粉生活力測定 利用FDA(熒光素二醋酸酯)對15個天然三倍體植株的花粉染色后，立即在激光共聚焦顯微鏡(Leica SP2)下進行觀察。采用Transmission掃描和波長488 nm的激光激發，圖像文件均儲存于計算機中，并以512×512像素類型保存。

將FDA染色法測定生活力最高的一個株系的花粉，采用醋酸洋紅染色法、TTC(氯化三苯基四氮唑)法及胡適宜等方法進行花粉生活力檢測。其中，各染色法的試驗編號分別為I：FDA染色法；II：醋酸洋紅染色法；III：TTC染色法；IV：離體萌發法(表3)。

統計時每一個樣品分別隨機取5個的視野(花粉萌發以花粉管長度大于花粉直徑為標準)，重復3次，計算平均值獲得花粉活力百分數。并對不同方法的結果進行比較分析。

1.2.3 花粉在柱頭上的萌發及花粉管的生長 于晴天的10：00-16：00，在枇杷花蕾開放之前進行授粉。授粉組合分別為2x×2x，2x×3x，3x×2x，3x×3x，分別于4h、8h、12h、16h、20h、24h、48h取授粉后雌蕊，每處理各取5枚雌蕊。以FAA固定液固定。參照胡適宜的方法，在Leiea BM4000熒光顯微鏡下觀察花粉在柱頭上的萌發情況，以目鏡測微尺測量花粉管生長的長度，數碼相機照相。

2 結果與分析

2.1 龍泉1號天然三倍體枇杷花粉形態特征

通過觀察發現，龍泉1號二倍體枇杷正常(圖版-la-lc)呈長球形，極面觀為三裂圓形；沿花粉粒極軸方向等距離分布有3條萌發溝，由極面向赤道面呈對稱輻射狀，三溝狹長至中部變窄，溝寬1～2μm，溝長(28±1.5)μm，溝在極面不匯合，有較小的溝界極區，按埃爾特曼的NPC分類系統，屬于N₃P₄C₅類型。花粉粒外壁為條紋狀紋飾。而15個龍泉1號天然三倍體枇杷花粉均表現形態多樣，經歸納大致包含6種形態(圖版-2a-2g)，其中，形態Ⅰ：畸形三溝長球形、有2個溝界區，Ⅱ：畸形六溝近球形、有4個溝界區，Ⅲ：完全球形、萌發溝均勻散布于球面、無溝界區，Ⅳ：畸形六溝扁球形、有3個溝界區，Ⅴ：畸形四溝狀、有3個溝界區，Ⅵ：三溝長球形、萌發溝近極分布。由此可見不同形態間差異極大，且萌發溝分布多樣化，表面紋飾模糊，紋飾類型多樣化；大多數花粉粒呈現表面褶皺的球體：花粉的飽滿程度也有很大差異，干癟花粉所占比例較高(表1)。

2.2 三倍體株系花粉生活力的FDA檢測

由表2看出，龍泉1號二倍體花粉的生活力為88.60％；天然三倍體株系中。B355的花粉生活力最低為3.83％，b38的花粉生活力最高，達28.70％。部分株系之間花粉活力達到顯著差異。

2.3 不同檢測方法結果比較

本研究中，將FDA檢測所獲得花粉活力最高的株系b38，分別采用醋酸洋紅染色法、TTC法、離體萌發法進行了生活力檢測。結果顯示：FDA熒光染色法與醋酸洋紅染色法測定的活力值不存在顯著差異，而TTC法、離體萌發結果均表現極顯著差異。從總體趨勢來看4種方法的測定結果呈現出一致性，因此，在枇杷三倍體、二倍體的花粉活力檢測上都是有效的，它們都能在一定程度上反映花粉活力的相對強弱。若研究中以花粉萌發為基礎，則以FDA熒光染色法最為接近實際的離體萌發率(表3)。

2.4 花粉在柱頭上的萌發及花粉管生長

由圖1，2可以看出，除在雜交組合3x×3x中，授粉后4h、8h未觀察到花粉在柱頭上萌發外，其余組合在不同時間段均觀察到花粉萌發。其中，二倍體的花粉在授粉后20～24h快速生長，授粉后24h，生長最快的花粉管已基本到達花柱基部，絕大部分花粉管長度到達花柱的2／3；授粉后48h，花粉管部分到達花柱基部。三倍體的花粉在柱頭上萌發量少，在授粉后14～18h為花粉管快速生長期，之后花粉管生長基本停滯，其絕大部分長度在150～225μm。這表明花粉在柱頭上的萌發情況及生長速度只與花粉的倍性相關，而與母本倍性無關。

從圖3、4可知，不同倍性植株的花粉在柱頭上的生長速度有差異。二倍體的花粉授粉4h后已萌發，在48h后花粉管生長超過2200μm，基本到達花柱基部，而在20～24h生長最快，達70.5μm·h^-1。三倍體的花粉從授粉后12h開始顯著萌發，在16 h后花粉管生長達到200μm，此后生長減緩并逐漸停滯，花粉管在12-16 h生長速度最快，達到23μm·h^-1。這說明枇杷花粉管在生長過程中呈非勻速生長狀態。

3 討論

種子植物的成熟花粉形態結構穩定，因此，研究花粉形態構造可為植物的起源、演化和植物分類提供重要的依據，且被應用。對于枇杷，人們認為通過電鏡掃描花粉外觀形態，可以作為鑒定品種的途徑之一。陸修閩等㈣還曾對早種6號及其雜交親本進行了鑒定，且認為這種處理方法有別于明暗分析方法，使其更為直觀、準確。本試驗結果表明龍泉1號二倍體枇杷的花粉為N₃P₄C₅類型，與前人研究結果一致；而不同三倍體株系中大致包含6種形態花粉，這也可以作為初步判定龍泉1號天然三倍體植株的指標之一。

醋酸洋紅染色法、TTC法和離體萌發是花粉生活力測定的常用的方法。張子學等舊認為TrC法和離體萌發適用于不同貯藏時間的花粉生活力的測定，而醋酸洋紅染色法適用于新鮮花粉生活力的測定，而利用FDA熒光染色進行測定的報道較少。本研究表明，4種方法對于枇杷花粉生活力的測定都是有效的。采用FDA熒光染色法操作程序簡單快捷，并且適宜于進行大批量樣品的快速測定。若研究中以花粉萌發為基礎。則以FDA染色法最為接近實際的離體萌發率，這對快速判定三倍體枇杷的相對生活力極為有效。

三倍體植株的花粉由于在減數分裂中，會出現較多的異常現象，產生大量畸形的花粉，從而導致花粉不育或敗育，而部分具有整倍性的花粉，或者一些亞整倍體、超整倍體的減數分裂及育性和真正的整倍體極其類似，均呈現可育性，這在本試驗中檢測各個三倍體株系花粉均具有一定生活力得到驗證。此外，Ca²⁺、pH(H+)及硼酸等在介質中的含量對花粉萌發、花粉管生長極為重要，而Ca²⁺分布還對于花粉識別以及花粉管生長均具有重要的定向和調節作用。本研究中三倍體花粉在柱頭中生長的停滯現象，推測可能與花粉和花柱中鈣離子分布相關。要探明三倍體枇杷花粉生活力低和在花柱中生長停滯的原因，尚待對信號傳導和調節作用的深入研究。

4 結論

二倍體枇杷花粉呈長球形，沿花粉粒極軸方向等距離分布有3條萌發溝，屬于N₃P₄C₅類型。而15個龍泉1號天然三倍體枇杷花粉均包含6種形態，且不同形態間差異極大；萌發溝分布多樣化，表面紋飾模糊，紋飾類型多樣化，大多數花粉粒呈現表面褶皺的球體。FDA熒光指示、TTC染色、醋酸洋紅染色、花粉的離體萌發4種方法測定花粉生活力都是有效的。他們都能在一定程度上反映花粉活力的相對強弱。FDA測定結果更接近離體萌發率。花粉管在柱頭中為非勻速生長，花粉在柱頭上的萌發主要取決于枇杷花粉的生活力，而與母本的倍性關系較小。